曹建光，曲波，馮磊，于子翔， 陳磊，王豐，付志達(dá)

(北京大學(xué)首鋼醫(yī)院，北京100041)

微小RNA(microRNA)是真核生物體內(nèi)一類長度約20～25個(gè)核苷酸的小分子非編碼單鏈RNA，microRNA與靶基因信使RNA(mRNA)的3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)相互作用，抑制mRNA的翻譯或誘導(dǎo)其降解，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)[1, 2]。研究表明，microRNA異常表達(dá)能夠?qū)е露喾N疾病的發(fā)生，尤其是腫瘤，microRNA在腫瘤發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移以及放化療耐藥中均發(fā)揮重要的作用[3, 4]。MicroRNA-34家族包括microRNA-34a、microRNA-34b和microRNA-34c三個(gè)成員，由2個(gè)不同基因編碼，microRNA-34b與microRNA-34c共享一個(gè)轉(zhuǎn)錄本，其編碼基因位于染色質(zhì)11q23，microRNA-34a具有獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄本，其編碼基因位于染色質(zhì)1p36[5]。大量研究證實(shí)，microRNA-34a基因在乳腺癌、結(jié)腸癌和肺癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞和組織中都存在啟動(dòng)子區(qū)的高度甲基化，導(dǎo)致microRNA-34a基因表達(dá)沉默[6]。此外，microRNA-34a能夠阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞壞死和凋亡，具有抑癌基因的功能[7]。然而，關(guān)于microRNA-34a在肺癌患者癌組織中的表達(dá)及其對(duì)肺癌影響的報(bào)道尚少。本研究檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者癌組織和癌旁正常組織中microRNA-34a表達(dá)，探討其表達(dá)與NSCLC臨床病理參數(shù)、化療效果和預(yù)后的關(guān)系，旨在為NSCLC患者的診斷和治療提供思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2012年1月～2015年6月收治100例NSCLC患者的癌組織及其癌旁正常組織的手術(shù)標(biāo)本，分別為觀察組和對(duì)照組?；颊呒{入標(biāo)準(zhǔn)：具有完整的病例資料，簽署知情同意書，術(shù)后病理診斷為NSCLC；排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤、全身感染性疾病、肝腎疾病。入組患者男62例、女38例，年齡<60歲患者43例，≥60歲患者57例；吸煙患者73例，不吸煙患者27例；病理分級(jí)低分化67例，中高分化33例；組織學(xué)分型為鱗癌58例，腺癌34例，其他型肺癌8例；有淋巴轉(zhuǎn)移83例，無淋巴轉(zhuǎn)移17例；TNM分期Ⅰ+Ⅱ期32例，Ⅲ+Ⅳ期68例。本研究已經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核同意，患者均簽署知情同意書。

1.2 兩組標(biāo)本microRNA-34a檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)法。Trizol法提取NSCLC癌組織及癌旁正常組織中總RNA，操作步驟參照RNA提取試劑盒的說明書。紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA濃度及純度(OD260/OD280)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，cDNA產(chǎn)物置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩icroRNA-34a正向引物5′-TGGCAGTGTCTTAGCTGGTTG-3′，反向引物5′-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3′；內(nèi)參U6正向引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。采用定量PCR擴(kuò)增儀檢測(cè)microRNA-34a相對(duì)表達(dá)水平。qRT-PCR反應(yīng)體系為10 μL，反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10min，然后95 ℃ 15s、60 ℃ 1 min進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt表示microRNA-34a相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 兩組microRNA-34a表達(dá)比較 觀察組、對(duì)照組microRNA-34a表達(dá)量分別為0.24±0.13、1.05±0.18，兩組相比，P<0.05。

2.2 NSCLC組織中microRNA-34a表達(dá)與NSCLC臨床病理參數(shù)的關(guān)系 NSCLC組織中microRNA-34a表達(dá)與NSCLC患者的年齡、性別和吸煙無關(guān)(P均>0.05)，與病理分級(jí)、組織學(xué)分型、淋巴轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)(P均<0.05)。詳見表1。

表1 NSCLC癌組織中microRNA-34a表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 NSCLC組織中microRNA-34a表達(dá)與化療療效的關(guān)系 本組共有82患者完成了6個(gè)周期的化療。根據(jù)RECIST標(biāo)準(zhǔn)[8]，參考CT結(jié)果以及腫瘤標(biāo)志物對(duì)化療效果的評(píng)價(jià)，將患者按照化療效果分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、病變穩(wěn)定期(SD)和病變進(jìn)展期(PD)?；熡行?CR+PR)的58例患者和化療無效(SD+PD)的24例患者NSCLC組織microRNA-34a表達(dá)量分別為0.36±0.19、0.21±0.14，兩組相比，P<0.05。

2.4 NSCLC組織microRNA-34a表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 以中位數(shù)為界限，將NSCLC患者分為microRNA-34a低表達(dá)者50例與microRNA-34a高表達(dá)者50例，繪制Kaplan-Meier生存曲線。microRNA-34a高表達(dá)組NSCLC患者的5年總生存率為92.00%(46/50)，顯著高于microRNA-34a低表達(dá)組者的70.00%(35/50)，P<0.05。microRNA-34a高、低表達(dá)者的生存時(shí)間分別為(56.94±1.56)、(52.54±2.24)個(gè)月，P<0.05。

3 討論

世界范圍內(nèi)，肺癌是導(dǎo)致人類死亡的主要惡性腫瘤之一。研究發(fā)現(xiàn)，我國肺癌的發(fā)病率和病死率居高不下，約占所有惡性腫瘤的20%～25%[9]。NSCLC是最常見的肺癌類型，約占肺癌發(fā)病人群的80%左右[10]。侵襲轉(zhuǎn)移和放化療耐藥是導(dǎo)致NSCLC患者不良預(yù)后的主要因素[11]，因此深入探究NSCLC發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移和放化療耐藥的內(nèi)在機(jī)制，尋找能夠逆轉(zhuǎn)侵襲轉(zhuǎn)移和放化療耐藥的生物靶標(biāo)，是臨床亟需解決的問題之一。近年來，關(guān)于microRNA在腫瘤發(fā)生和惡性進(jìn)展中的功能研究，已成為研究熱點(diǎn)，如有研究證實(shí)，microRNA-29b在結(jié)腸癌的癌組織和血清中均低表達(dá)，血清microRNA-29b表達(dá)水平可以作為結(jié)腸癌的潛在診斷指標(biāo)[12]。MicroRNA-34a在多種惡性腫瘤中發(fā)揮抑癌基因的功能，如在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中，microRNA-34a參與抑制細(xì)胞周期和細(xì)胞老化過程[13]；在乳腺癌中microRNA-34a與HER2表達(dá)水平之間呈負(fù)相關(guān)性，microRNA-34a表達(dá)丟失有望成為乳腺癌的潛在診斷指標(biāo)之一[14]。本研究結(jié)果顯示，NSCLC組織中microRNA-34a表達(dá)水平明顯低于癌旁正常組織，初步證實(shí)microRNA-34a在NSCLC發(fā)生過程中具有抑癌基因功能，與Zhou等[15]在胃癌中對(duì)microRNA-34a的研究結(jié)果一致。

此外，本研究對(duì)microRNA-34a表達(dá)與NSCLC患者臨床病理特征之間關(guān)系的研究發(fā)現(xiàn)， microRNA-34a低表達(dá)與NSCLC患者癌組織的病理分級(jí)、組織學(xué)分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期密切相關(guān)，提示在NSCLC組織中microRNA-34a低表達(dá)預(yù)示著患者的癌組織分化程度較低，可能存在淋巴轉(zhuǎn)移以及可能處于疾病晚期，但是關(guān)于microRNA-34a在NSCLC腫瘤發(fā)生及惡性進(jìn)展中的發(fā)揮的具體作用機(jī)制，本研究并未進(jìn)行深入探討。大量研究證實(shí)，microRNA-34a具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲遷移等功能，如在絨毛膜癌細(xì)胞中，microRNA-34a抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲[16]；在骨肉瘤細(xì)胞中microRNA-34a通過抑制CD44基因表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力下降[17]；此外，microRNA-34a通過下調(diào)ALDH2基因表達(dá)，促進(jìn)心肌梗死后的心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡[18]。本研究后期將對(duì)microRNA-34a在NSCLC腫瘤發(fā)生及惡性進(jìn)展中的具體作用機(jī)制做進(jìn)一步地研究。本研究結(jié)果顯示，化療有效組(CR+PR)患者的癌組織中microRNA-34a表達(dá)水平顯著高于化療無效組(SD+PD)，表明microRNA-34a在NSCLC獲得性化療耐藥中發(fā)揮作用，但并未對(duì)內(nèi)在具體機(jī)制進(jìn)行深入研究。Zhou等[19]的研究發(fā)現(xiàn)，在NSCLC細(xì)胞中過量表達(dá)microRNA-34a后，細(xì)胞增殖被抑制，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，且能夠部分逆轉(zhuǎn)細(xì)胞對(duì)吉非替尼的化療耐藥；Duan 等[20]在NSCLC細(xì)胞中的研究發(fā)現(xiàn)，恢復(fù)microRNA-34a表達(dá)后，能夠抑制LyGDI信號(hào)通路活性，從而增強(qiáng)細(xì)胞的放療敏感性，microRNA-34a有望成為NSCLC患者的放療增敏劑，提高NSCLC患者的放療療效。此外，Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果顯示，microRNA-34a低表達(dá)組NSCLC患者的5年總生存率、平均生存時(shí)間均明顯低于microRNA-34a高表達(dá)組，表明microRNA-34a低表達(dá)NSCLC患者的預(yù)后并不樂觀，microRNA-34a具有作為NSCLC患者不良預(yù)后指標(biāo)的潛力。

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