趙粉琴，徐世倩，袁愛倩，李娜娜

甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，甘肅 蘭州 730000

卵巢顆粒細(xì)胞是圍繞卵泡外最多的、起營養(yǎng)作用的細(xì)胞群，其生長及增殖與促進(jìn)卵泡的生長、閉鎖、排卵有關(guān)，顆粒細(xì)胞的凋亡是卵泡閉鎖的主要機(jī)制，也是引起女性內(nèi)分泌功能失調(diào)的主要原因[1]。細(xì)胞在程序性凋亡的過程中胱天蛋白酶-3

(Caspase-3)作為細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶，能促進(jìn)細(xì)胞凋亡?；熓侵委煇盒阅[瘤的常用方法，化療導(dǎo)致卵巢功能的主要損傷是卵泡數(shù)量下降，卵巢纖維化。丙二醛(Malondialdehyde，MDA)是體內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的終末產(chǎn)物，MDA的高低又間接反應(yīng)了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的程度[2]。因此探討順鉑(Cisplatin，CDDP)損傷后MDA和Caspase-3蛋白在顆粒細(xì)胞中的表達(dá)以及當(dāng)歸補(bǔ)血湯的干預(yù)作用，能為當(dāng)歸補(bǔ)血湯的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器 Annexin V-FITC/P1細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購于貝博生物公司(產(chǎn)品號(hào)：BB-4101-100T，批號(hào)：BB150041)，DME/F12 1∶1培養(yǎng)液購于上海連碩生物科技有限公司(批號(hào)SH30023.01)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)儀(美國Coulter公司，Epics2XL型)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清制備 當(dāng)歸補(bǔ)血湯方由黃芪60 g，當(dāng)歸12 g組成。以上中藥加入20倍量的水煎煮2次，每次1.5 h。過濾，蒸發(fā)濃縮為含生藥量1 g/mL水煎劑。選用8周齡SD大鼠10只[動(dòng)物實(shí)驗(yàn)合格證：SYXK(甘)2015-0005]，根據(jù)大鼠與人體表面積換算，給予當(dāng)歸補(bǔ)血湯高劑量(10 g/kg，臨床10倍用量)灌胃，每天早晚2次，連續(xù)灌胃5天。第5天末次灌胃1 h后各組大鼠予以戊巴比妥鈉30mg/kg麻醉，頸主動(dòng)脈取血5mL，離心，無菌分離血清，經(jīng)56℃，水浴30min滅活補(bǔ)體后，用0.22μm的微孔濾膜過濾除菌，-20℃保存?zhèn)溆?。制備成?dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清：低劑量組(0.5%含藥血清)：0.05mL含藥血清+9.95mL正常血清；中劑量組(2.5%含藥血清)：0.25mL含藥血清+9.75mL正常血清；高劑量組(10.0%含藥血清)：1mL含藥血清+9mL正常血清。

1.2.2 大鼠卵巢顆粒細(xì)胞培養(yǎng) 從甘肅中醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購買3～4周齡雌性SD大鼠[動(dòng)物實(shí)驗(yàn)合格證：SYXK(甘)2015-0005]適應(yīng)性喂養(yǎng)2天，皮下注射孕馬血清促性腺激素40 IU/只，48 h后頸椎脫臼法處死，無菌條件下取出卵巢，用預(yù)冷的PBS液體清洗，去除卵巢周圍的脂肪和包膜，用1mL空針針頭刺破卵泡，剔除大塊卵巢組織碎片后1 500 r/min離心8min，加入培養(yǎng)液清洗2次后，棄上清收集顆粒細(xì)胞，巴氏管輕輕吹打，200目不銹鋼細(xì)胞篩過濾，在無血清DMEM/F12培養(yǎng)基，37℃，5%CO2溫箱中培養(yǎng)。

1.2.3 細(xì)胞分組 把用CDDP處理48 h卵巢顆粒細(xì)胞依據(jù)作用藥物分為①空白組：單純顆粒細(xì)胞和培養(yǎng)液；②模型組：順鉑+顆粒細(xì)胞組；③當(dāng)歸補(bǔ)血湯低劑量治療組(低劑量組)：0.5%含藥血清；④當(dāng)歸補(bǔ)血湯中劑量治療組(中劑量組)：2.5%含藥血清；⑤當(dāng)歸補(bǔ)血湯高劑量治療組(高劑量組)：10%含藥血清。

1.2.4 MTS監(jiān)測(cè)大鼠顆粒細(xì)胞增殖率 取生長旺盛的第4天細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化1 000 r/min離心8min后棄上清收集細(xì)胞。顯微鏡下計(jì)數(shù)后，按2.5×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，按每孔100μL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。DMEM/F12培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h后見有細(xì)胞貼壁，換液繼續(xù)培養(yǎng)。按不同藥物濃度處理細(xì)胞，每孔培養(yǎng)總體積100μL。繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，37℃水浴10min，融化MTS試劑，在96孔板中，每孔加入20μL單溶液96孔細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑(CellTiter96RAQueous one solution reagent)，37℃、5%CO2環(huán)境培養(yǎng)1～4 h，490 nm讀取吸光度值。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)CDDP對(duì)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的影響 取24 h細(xì)胞貼壁生長的細(xì)胞，分別用不同濃度(0、2.5、5.0、10.0、12.5μg/mL)CDDP處理細(xì)胞，48 h后將各組顆粒細(xì)胞用胰酶消化3min，吹打收集細(xì)胞于10mL離心管中，反復(fù)用磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸洗滌，用預(yù)冷的70%乙醇固定過夜，加入Annexin V標(biāo)記蛋白和相應(yīng)的核酸染料，混合均勻，室溫避光反應(yīng)20～30min。再加入0.5mL的pH 7.2的PBS，靜置5min，離心10min，沉淀再用PBS洗滌2次后，并用1mL PBS懸浮起細(xì)胞，及時(shí)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，采集細(xì)胞的DNA數(shù)據(jù)。

1.2.6 MTS檢測(cè)當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清對(duì)CDDP損傷大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的增殖作用 顆粒細(xì)胞按2.5×104個(gè)/孔100μL接種至96孔板，每孔加入0.1mLDMEM(Dulbecco'smodified eagle medium)培養(yǎng)液(加10%小牛血清)，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h細(xì)胞生長達(dá)80%融合。空白組僅加入等容量無血清培養(yǎng)基；模型組加入等容量5μg/mLCDDP和無血清培養(yǎng)基；當(dāng)歸補(bǔ)血湯低、中、高劑量組加入等容量5μg/mLCDDP及分別加入0.5%、2.5%、10.0%的含藥血清。各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后去除培養(yǎng)液，每孔加0.1mL系列稀釋的待測(cè)樣品標(biāo)準(zhǔn)品和MTS/PMS(吩嗪硫酸甲酯)混合液20μL，繼續(xù)孵育4 h顯色。并在酶標(biāo)儀上490 nm波長處測(cè)光密度值(OD)，以檢測(cè)其細(xì)胞增殖情況。增殖抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD/對(duì)照組OD)×100%。

1.2.7細(xì)胞液中雌二醇（Estradiol-2，E2）和MDA水平測(cè)定收集培養(yǎng)48 h后的細(xì)胞上清液，用化學(xué)發(fā)光法測(cè)定各組細(xì)胞上清液中的雌激素水平。按照試劑盒說明書操作測(cè)定MDA含量。

1.2.8 Western blot檢測(cè)Caspase-3蛋白表達(dá)水平 待各組細(xì)胞生長至融合度為90%時(shí)取出，細(xì)胞刮至瓶底一角，收集至預(yù)冷的EP管中，PBS清洗細(xì)胞3次，4℃，離心1 000 r/min，10min，棄上清，加入蛋白抑制劑的RIPA裂解液200μL，并反復(fù)吹打10次左右，冰上靜置30 min，再次離心12 000 r/min、4℃，取上清至EP管中(即所需蛋白提取液)；蛋白變性后，每孔上樣量20μL，電泳，轉(zhuǎn)膜3 h，分別加入Caspase-3蛋白一抗37℃水浴孵育1 h后，4℃過夜，第2天加入二抗37℃水浴孵育1 h，然后暗室中加入ECL發(fā)光液，X光膠片曝光30 min，掃描圖像并且分析結(jié)果，比較目的蛋白與內(nèi)參β-actin條帶的光密度值。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以(±s)表示，兩樣本比較采用配對(duì)資料t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 卵巢顆粒細(xì)胞陽性率檢測(cè)結(jié)果 見圖1。大鼠卵巢顆粒細(xì)胞計(jì)數(shù)臺(tái)盼藍(lán)染色，卵巢顆粒細(xì)胞陽性率達(dá)到85%，符合實(shí)驗(yàn)要求。

2.2 各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡率結(jié)果比較 見圖2、表1。與0.0μg/mL CDDP組比較，不同濃度 CDDP(2.5、5.0、10.0、12.5μg/mL)對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞生長都有抑制作用，濃度越高抑制作用越明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

圖1 大鼠卵巢顆粒細(xì)胞臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果(×400)

圖2 流式細(xì)胞儀監(jiān)測(cè)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡率

表1 不同濃度CDDP對(duì)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡率的影響(±s)%

表1 不同濃度CDDP對(duì)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡率的影響(±s)%

與0.00μg/mLCDDP組比較，①P＜0.01

組 別0μg/mLCDDP組2.5μg/mLCDDP組5.0μg/mLCDDP組10.0μg/mLCDDP組12.5μg/mLCDDP組凋亡率5.925±0.030 0 42.850± 0.041 0①70.500± 0.017 3①80.250± 0.045 0①92.230± 0.051 4①

2.3 各組卵巢顆粒細(xì)胞增殖率結(jié)果比較 見表2。與空白組比較，模型組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞增殖率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，表明CDDP對(duì)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞有明顯的抑制作用。與模型組比較，當(dāng)歸補(bǔ)血湯低、中劑量治療組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞增殖率明顯升高，以中劑量組的改善作用最明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

表2 各組卵巢顆粒細(xì)胞增殖率結(jié)果比較(±s) %

表2 各組卵巢顆粒細(xì)胞增殖率結(jié)果比較(±s) %

與空白組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.01；與低劑量組比較，③P＜0.01；與高劑量組比較，④P＜0.01

組 別空白組模型組低劑量組中劑量組高劑量組24 h 0.162±0.0095 0.105±0.013 0①0.134±0.0103②0.136±0.0111②④0.095± 0.012 9③48 h 0.238±0.008 7 0.111±0.0179①0.157±0.0132②0.197±0.011 5②③④0.111±0.014 9③72 h 0.186±0.017 1 0.105±0.0129①0.135±0.0097②0.168±0.015 3②③④0.084± 0.010 8②③

2.4 各組卵巢顆粒細(xì)胞培養(yǎng)液中E2和MDA水平比較 見表3。與空白組比較，模型組卵巢顆粒細(xì)胞培養(yǎng)液中E2水平明顯下降，MDA明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；與模型組比較，當(dāng)歸補(bǔ)血湯高、中、低劑量治療組顆粒細(xì)胞培養(yǎng)液中E2水平明顯上升，MDA明顯下降，以中劑量組的改善作用最明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

表3 各組卵巢顆粒細(xì)胞培養(yǎng)液中E2和MDA水平比較(±s)

表3 各組卵巢顆粒細(xì)胞培養(yǎng)液中E2和MDA水平比較(±s)

與空白組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.01；與低劑量組比較，③P＜0.01；與高劑量組比較，④P＜0.01

組 別空白組模型組低劑量組中劑量組高劑量組E2(pg/L)9.65±0.528 4.24± 1.213①6.08± 1.223②7.44± 1.037②③④5.74± 0.510②③MDA(mmol/mL)1.370±0.069 2.670± 0.088①2.402± 0.300②1.980± 0.112②③④2.300± 0.215②③

2.5 各組顆粒細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)相對(duì)灰度值比較 見表4、圖3。與空白組比較，模型組顆粒細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與模型組比較，中劑量組卵巢顆粒細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

3 討論

細(xì)胞凋亡是由多個(gè)信號(hào)通路調(diào)控的一個(gè)程序性細(xì)胞死亡過程，Caspases激活的線粒體途經(jīng)是調(diào)節(jié)機(jī)制比較明確的細(xì)胞凋亡過程。Caspases家族承擔(dān)著重要的凋亡調(diào)控作用，其中Caspases-3是最重要的凋亡執(zhí)行者。Bcl-2是通過干擾細(xì)胞色素C的釋放而阻斷上游Caspase蛋白酶的激活，來抑制細(xì)胞凋亡的[3]。一旦Caspase-3被激活，將使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)降解，使細(xì)胞不可逆地走向死亡。有文獻(xiàn)報(bào)道，顆粒細(xì)胞是卵泡外層最豐富的細(xì)胞，提供卵母細(xì)胞發(fā)育所需要的營養(yǎng)及平衡細(xì)胞微環(huán)境，促進(jìn)卵母細(xì)胞的發(fā)育及成熟，顆粒細(xì)胞開始程序性死亡是卵泡閉鎖的標(biāo)志[4]。當(dāng)歸補(bǔ)血湯是李東恒所創(chuàng)由黃芪、當(dāng)歸以5∶1配伍而成，是補(bǔ)氣生血代表方，實(shí)驗(yàn)研究表明其主要有效成分當(dāng)歸多糖和阿魏酸對(duì)血細(xì)胞生成過程的直接影響最為顯著[5]。

表4 各組顆粒細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)相對(duì)灰度值比較(±s)

表4 各組顆粒細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)相對(duì)灰度值比較(±s)

與空白組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.01；與低劑量組比較，③P＜0.01；與高劑量組比較，④P＜0.01

組 別空白組模型組低劑量組中劑量組高劑量組Caspase-3蛋白0.017 2±0.008 0.841 0± 0.010①0.717 3±0.006 0.553 0± 0.006②③④0.787 0± 0.009③

圖3 各組顆粒細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)使用含藥血清觀察當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)大鼠卵巢離體顆粒細(xì)胞增殖的影響，MTS法檢測(cè)結(jié)果表明當(dāng)歸補(bǔ)血湯可促進(jìn)CDDP損傷大鼠離體卵巢顆粒細(xì)胞增殖，其促細(xì)胞增殖呈時(shí)間濃度相關(guān)性。尤其在48 h增殖最顯著，而且與濃度有關(guān)，當(dāng)濃度為2.5%的含藥血清時(shí)細(xì)胞增殖作用最顯著，但是當(dāng)濃度大于10%或小于2.5%時(shí)，細(xì)胞的增殖能力沒有進(jìn)一步增加。以往報(bào)道當(dāng)歸補(bǔ)血湯可以促進(jìn)離體大鼠顆粒細(xì)胞增殖作用，但其具體機(jī)制不明。衰老的自由基學(xué)說為目前國際學(xué)術(shù)界所公認(rèn)，有研究證明，衰老小鼠卵巢MDA含量明顯升高[6]；氧自由基的變化可促使活性氧對(duì)蛋白、膜脂和DNA的損傷，在不同程度上引起卵巢功能的減退[7]。細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞主動(dòng)性死亡過程，氧化應(yīng)激過程中產(chǎn)生過多的氧自由基可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[8]。

本實(shí)驗(yàn)研究表明CDDP損傷大鼠顆粒細(xì)胞明顯促進(jìn)MDA和Caspase蛋白的表達(dá)，而且在顆粒細(xì)胞增殖被抑制明顯階段，這2種蛋白呈現(xiàn)高表達(dá)。CDDP抑制大鼠卵巢顆粒細(xì)胞中MDA呈明顯升高趨勢(shì)，過氧化效應(yīng)可直接導(dǎo)致MDA增加，從而使細(xì)胞外基質(zhì)呈強(qiáng)表達(dá)，由此推測(cè)，氧化損傷作用增強(qiáng)是導(dǎo)致顆粒細(xì)胞凋亡的主要原因之一。推測(cè)當(dāng)歸補(bǔ)血湯可能通過抑制CDDP損傷大鼠卵泡顆粒細(xì)胞MDA合成，避免氧化應(yīng)激損傷，減少顆粒細(xì)胞凋亡，來促進(jìn)卵母細(xì)胞生長和成熟。

本研究結(jié)果表明，當(dāng)歸補(bǔ)血湯可能是通過當(dāng)歸和黃芪抑制凋亡分子途徑的激活，有效地調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激所致的凋亡事件，從而停止活性氧(Reactive oxygen species，ROS)自由基的活性，減少線粒體膜電位的損失，抑制MDA減少氧化應(yīng)激損傷，降低氧化應(yīng)激的發(fā)生，降低Caspase-3蛋白酶表達(dá)，減少顆粒細(xì)胞凋亡，其具體作用機(jī)制，以及時(shí)間量效關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

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