廖榮鑫，劉小虹，許仕杰

1.廣東藥科大學附屬第三醫(yī)院，廣東 廣州 510410；2.廣州中醫(yī)藥大學，廣東 廣州 510006

脾胃濕熱證是臨床常見的脾胃實證，中醫(yī)認為其形成與氣候、飲食內(nèi)傷、疫氣以及體質因素有關。由于脾胃濕熱證的特殊致病因素及其病理變化的特點，目前研究還處于籠統(tǒng)、多指標、不確定狀態(tài)，缺乏一個整體、統(tǒng)一的評價標準，有待進一步多學科綜合研究。證候蛋白質組學的提出，為整體研究證候實質提供可能。血清中含有近萬種蛋白質，成分復雜，包括各種不同器官、組織和細胞分泌的多種蛋白質，機體每一時間段的病理生理改變均可在血清中反映出來[1]。因而從血清蛋白質組學的角度，將蛋白質組學和中醫(yī)證型研究結合起來，探討脾胃濕熱證在某一時期的相關蛋白質，對從整體水平研究、評價脾胃濕熱證的實質具有重要的現(xiàn)實意義。本研究從動物模型入手，對與脾胃濕熱證模型大鼠相關的血清差異表達蛋白質進行探討。

1 材料和方法

1.1 動物分組與模型制備 實驗用動物為6周齡SPF級SD雄性大鼠20只，購自廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心，實驗動物使用許可證號：SYXK(粵)2003-0001，批次：20060241，于廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF級動物實驗室飼養(yǎng)，體質量(178.27±4.79)g。按照隨機數(shù)字表將實驗大鼠隨機分為模型組和正常對照組，每組10只。模型組大鼠于造模前禁食12 h，自由飲水，測定肛溫、體質量、飲食量。造模時間共28天，采用肥甘飲食+造模箱+大腸桿菌造模法[2]。肥甘飲食(在普通飼料中混入12%豬油，8%蜂蜜)喂養(yǎng)10天，然后置于造模箱[溫度(33±2)℃，相對濕度85%～95%]8天，第19天開始灌胃，按10mL/kg給予大腸桿菌1次，24 h后再加強感染1次(1mL/200 g)，移出置于實驗動物中心自然環(huán)境中，12 h后開始灌服蒸餾水，40mL/kg，每天2次，灌胃8天。正常對照組不予任何干預。

1.2 標本采集 第28天斷頭處死大鼠取全血，于4℃靜置30min后，以1 000 rpm的速度室溫離心5min，吸取上清液；置高速低溫離心機，在4℃條件下，以10 000 rpm的速度離心8min，再吸取上清液，分裝置－80℃低溫冰箱保存。

1.3 試劑和儀器 Sigma公司生產(chǎn)的3K18高速低溫離心機；AmershamPharmacia公司生產(chǎn)的IPGphor及附件、GS-710光密度透射掃描儀；Bio-Rad公司生產(chǎn)的ProteanⅡ垂直電泳單元及附件、Mini-PROTEAN電泳單元及附件；HITACHI公司生產(chǎn)的U-2001紫外分光光度計；北京四環(huán)科學儀器制造廠生產(chǎn)的恒溫循環(huán)器HX-1055。實驗中所用試劑有：三羥基甲基氨基甲烷堿Tris、十二烷基硫酸鈉SDS、Bromopheolblue、Ultra urea、IPG buffer(pH 4～7)、固相pH梯度干膠條(IPG strip，13 cm，pH 3～ 10)(均購自 AmershamPharmacia 公司)；AAm、Bis、Gly(購自 Bio-Rad 公司)；PMSF(購自 Merck 公司)；TEMED、Pharmalyte(pH 3～ 10)、CHAPS(購自 Sigma 公司)；IAA、G250/R250(Fluka公司，批號：194863)；LMWmarker(購自華美生物工程公司，批號：20061458)；二硫蘇糖醇DTT(購自Promega公司)，BSA(購自中國醫(yī)學科學院血液學研究所，批號：20061625)。

1.4 二維凝膠電泳（2-DE） 分離和分析 考馬斯亮藍G250法[3]測定血清蛋白質濃度，然后按等質量分別混和模型組和正常對照組的血清樣本，以組間配對的方式同時進行2-DE分離。采用18 cm長，pH值為4～7的固相pH梯度干膠條，上樣量為2.0 mg，以AmershamPharmacia Biotech公司IPGphor水平電泳儀進行等電聚焦(isoelectric focusing，IEF)。IEF過程中采用濾紙片作為“鹽橋”，設定250 V 30min，500 V 30min的低電壓除鹽過程，總電壓時間積約為50 000 Vh。平衡后的膠條置12.5%濃度的SDS凝膠作第二相分離。以考馬斯亮藍G250對凝膠做膠體考染，用GS710光密度透射掃描儀掃描凝膠并保存圖像。每組實驗重復3次，共獲得6張2-DE凝膠圖像。以Image Master 2DElite軟件進行圖像分析，設定表達量提高2倍為差異表達范圍，獲取最終有差異表達的蛋白質斑點信息。

1.5 差異蛋白質的質譜分析和數(shù)據(jù)庫檢測 切取差異表達蛋白質斑點，經(jīng)水洗、脫色處理后進行膠內(nèi)酶切和萃取，獲得蛋白質的肽混合樣品，再以美國ABI公司的Voyager DE STRMALDI-TOF質譜儀對處理好的樣品進行質譜檢測，獲取肽質量指紋圖譜(peptidemass fingerprint，PMF)。以Mascot軟件搜索NCBInr和EMBL等數(shù)據(jù)庫，查詢PMF所對應蛋白質及相關信息。

2 結果

2.1 血清蛋白質差異表達蛋白分布圖 見圖1。在模型組大鼠和正常對照組大鼠血清中共找出12個表達量具有顯著差異的蛋白質斑點。

圖1 血清蛋白質差異表達蛋白分布圖位置(A為上調圖；B為下調圖)

2.2 血清差異表達蛋白質情況 見表1。按照在圖像中檢測到的序號來分，分別為點5、16、52、74、120、153、191、196、211、208、263、281。通過對PMF的數(shù)據(jù)庫檢索，12個血清差異蛋白質中除3個血清差異蛋白質未獲得滿意的PMF圖譜，故無法檢出其具體物質，其余9個可獲得數(shù)據(jù)庫的匹配信息，分別為備解素B因子、凝血因子Ⅱ、C-反應蛋白、alpha-胰蛋白酶抑制劑重鏈H4、載脂蛋白AI、重組人載脂蛋白AI、血小板凝血酶敏感蛋白、α-巨球蛋白、補體3。

3 討論

近年來，蛋白質組學作為后基因時代的標志，目前已運用到包括疾病標志物研究、作用機制研究、藥物作用靶點研究、個性化醫(yī)療等多個領域中[4]。將蛋白質組學引入到中醫(yī)證候的研究，主要通過對同一疾病不同證候和同一證候不同疾病的組織或細胞不同的蛋白質表達譜進行分析，發(fā)現(xiàn)證候間的相同及差異之處，進而揭示中醫(yī)證候的本質，蛋白質組學的整體性、復雜性、動態(tài)性、信息化的特點和中醫(yī)學的理念不謀而合[5]。袁宏偉等[6]運用蛋白質組學研究發(fā)現(xiàn)冠心病心腎陰虛證的內(nèi)在基礎，并找出了證型間的差異表達蛋白。孟慶宏等[7]分別從中醫(yī)證和蛋白質組的概念、內(nèi)涵、特點、共性等幾個方面對將蛋白質組學引入中醫(yī)證候的研究進行了探討，認為將蛋白質組學引入到中醫(yī)證候學研究，為中醫(yī)證候物質和功能基礎研究提供了新思路，對揭示中醫(yī)證的現(xiàn)代科學內(nèi)涵具有重要意義。

表1 血清差異表達蛋白質情況

從本研究篩選出的9個差異蛋白質可以看出，脾胃濕熱證模型大鼠差異表達的蛋白主要涉及機體免疫、物質代謝、炎癥反應及血液流變學等方面。與脾胃濕熱證免疫調節(jié)有關的蛋白有補體3、α-巨球蛋白、備解酶B因子。補體3、α-巨球蛋白表達均下降，備解素B因子表達上調，三者共同作用分別從激素調節(jié)、B淋巴細胞介導的免疫和受體分解等方面共同發(fā)揮作用，引起機體免疫力下降，和已有關于脾胃濕熱證免疫力下降的諸多研究結果[8～10]是一致的?！端貑枴氛J為：“脾胃為水谷之?！?、“脾胃為后天之本”，脾胃功能衰弱，脾胃運化水谷精微功能失調，則正氣受損，是易于感受外邪而發(fā)病的基礎。因此，研究提示的免疫調節(jié)蛋白表達下降，引起機體免疫功能減低，可能是脾胃濕熱證正氣不足，易受邪而發(fā)病的實質所在。

與機體炎癥反應有關的蛋白質有alpha-胰蛋白酶抑制劑重鏈H4和C-反應蛋白。C-反應蛋白是反映炎癥反應的指標[11]，alpha-胰蛋白酶抑制劑重鏈H4是感染、炎癥、創(chuàng)傷時常發(fā)生急性期反應蛋白[12]。在脾胃濕熱證大鼠血清中，C-反應蛋白表達下調，alpha-胰蛋白酶抑制劑重鏈H4表達上調。C-反應蛋白表達下降及alpha-胰蛋白酶抑制劑重鏈H4表達上調，這一結果與楊春波等[8]發(fā)現(xiàn)脾胃濕熱證涉及的病種中，以炎癥性疾病占大多數(shù)，尤其與以循環(huán)系統(tǒng)障礙、滲出為主的急性期炎癥和亞急性期炎癥更為密切，說明脾胃濕熱證炎癥的存在并不易愈合。

與機體營養(yǎng)物質代謝有關的蛋白質有重組人載脂蛋白AI及載脂蛋白AI，二者在調節(jié)脾胃濕熱證機體的脂肪代謝以及胰島素的釋放等方面發(fā)揮著重要的作用。重組人載脂蛋白AI及載脂蛋白AI表達均增強，提示機體脂肪蓄積太多，載脂蛋白表達增強，代償性加快脂類在機體內(nèi)的代謝，和模型動物使用高糖高脂飼料后表現(xiàn)為飲食減少、體質量增加有關；與中醫(yī)理論的脾主運化功能失常引起脾胃運化水谷功能下降，水濕內(nèi)停的理論一致。

與血液流變學有關的蛋白質有凝血因子Ⅱ、血小板凝血酶敏感蛋白，二者表達均增強。凝血因子Ⅱ是凝血酶原被激活形成凝血酶過程中釋放的產(chǎn)物，若增高提示體內(nèi)有凝血酶形成。脾胃濕熱患者存在著凝血方面的異常。研究表明慢性胃病不同證型都存在血流變的異常，脾胃濕熱證最突出，曹代娣[13]研究表明，血液流變異常程度為脾胃濕熱型＞肝郁氣滯型＞脾胃虛弱型。鄭家鏗等[14]研究發(fā)現(xiàn)脾胃濕熱證存在著高血黏、高血凝、高血細胞壓積等特點。凝血因子Ⅱ、血小板凝血酶敏感蛋白在脾胃濕熱證的表達均增強，說明脾胃濕熱證在血液流變學上具有高凝、高黏的特點，與先前學者的相關研究報道[15]相一致。

本研究從動物模型出發(fā)，初步探討了和脾胃濕熱證相關的血清特異表達蛋白質，這些蛋白主要涉及機體免疫、物質代謝、炎癥反應及血液流變學等方面，和現(xiàn)有的脾胃濕熱證的相關研究結果是一致的，證實了從蛋白質組的角度來研究脾胃濕熱證實質是可行的。中醫(yī)證型的形成和發(fā)展是多種因素共同作用的結果，今后還需要進一步將脾胃濕熱證相關的動物模型、臨床病例的血清或者組織差異表達蛋白質結合起來比較分析，對不同的差異表達蛋白進行鑒定和功能驗證，更深入地探討脾胃濕熱證的相關蛋白質，以闡釋脾胃濕熱證的實質。

[1] 鐘小蘭，呂志平，錢令嘉，等．肝郁證模型大鼠血清蛋白質組的差異表達研究[J]．中華中醫(yī)藥雜志，2006，21(7)：399-401．

[2] 吳仕九，楊運高．溫病濕熱證動物模型的研制及清熱祛濕法機理的探討[J]．中國中醫(yī)藥科技，1999，6(2)：65-67．

[3] Candiano G，BruschiM，Musante L，etal． Blue silver：a very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis[J]． Electrophoresis，2004，25(9)：1327-1333．

[4] 王常松，傅曉晴，劉清華，等．中醫(yī)證蛋白質組學研究探析[J]．中華中醫(yī)藥雜志，2011，26(3)：535-537．

[5] 王新賢，殷海波，姜泉，等．蛋白質組學在中醫(yī)證候學研究中的應用進展[J]．世界中醫(yī)藥，2017，12(8)：1965-1969．

[6] 袁宏偉，杜武勛，朱明丹，等．冠心病心氣虛弱證/心腎陰虛證血清蛋白質組學特征研究[J]．時珍國醫(yī)國藥，2012，23(4)：1014-1016．

[7] 孟慶宏，王常松，傅曉晴，等．蛋白質組學技術引入中醫(yī)證理論的可行性研究[J]．中醫(yī)學報，2011，26(2)：170-172．

[8] 楊春波，黃可成，肖可成，等．脾胃濕熱證的臨床研究-400例資料分析[J]．中醫(yī)雜志，1994，35(7)：425-427．

[9] 尹思源，張光華，張磊，等．慢性胃脘痛證候分布規(guī)律的調查(附115例典型病例分析)[J]．瀘州醫(yī)學院學報，1995，18(2)：109-111.

[10] 周正，黃志新，勞紹賢．脾胃濕熱證的現(xiàn)代研究進展[J]．湖南中醫(yī)藥導報，2003，9(6)：65-67．

[11] Choi-Miura NH，Takahashi K，Yoda M，et al． The novel acute phase protein，IHRP，inhibits actin polymerization and phagocytosis of polymorphonuclear cells[J]． InflammRes，2000，49(6)：305-310．

[12] Venugopal SK，Devaraj S，Jialal I． Effectof C reactive protein on vascular cell：evidence for a proinflamatory，proath erogenic role[J]． Curr Opin Nephrol Hypertens， 2005， 14(1)：33-37．

[13] 曹代娣．胃脘痛的宏觀辨證與微觀結合的初步探討[J]．遼寧中醫(yī)雜志，1994，21(2)：54-55．

[14] 鄭家鏗，張群豪，許少鋒，等．慢性胃病脾胃濕熱證與脾氣虛證的血液流變學觀察[J]．福建中醫(yī)學院學報，1994，4(2)：6-8．

[15] 侯冬梅，劉勤社，郭安陽．慢性萎縮性胃炎中醫(yī)證型與血液流變學的關系[J]．中國中西醫(yī)結合脾胃雜志，1997，5(1)：14-16．