彭志鵬，羅 丹，許 超，熊小文，溫慶琪，瞿明仁，歐陽克蕙*

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 江西省動(dòng)物營養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/營養(yǎng)飼料開發(fā)工程研究中心，江西 南昌 330045；2.上海美農(nóng)生物科技股份有限公司，上海 201800)

丁酸是瘤胃微生物產(chǎn)生的一種短鏈脂肪酸，是反芻動(dòng)物的重要能量來源[1]。但當(dāng)反芻動(dòng)物采食高精料日糧時(shí)，丁酸濃度可能會上升到正常情況下的2～3倍[2-3]，誘導(dǎo)亞急性瘤胃酸中毒的發(fā)生[4]，給現(xiàn)代反芻動(dòng)物生產(chǎn)帶來嚴(yán)重影響。許多研究顯示，丁酸對維持和保護(hù)上皮屏障結(jié)構(gòu)和功能有益，能促進(jìn)上皮細(xì)胞的增殖[5-6]。也有研究顯示，過高濃度的丁酸反而會促進(jìn)細(xì)胞凋亡[7-8]。反芻動(dòng)物發(fā)生瘤胃酸中毒情況下，往往造成瘤胃上皮屏障結(jié)構(gòu)破損和功能喪失[9-10]，這是否與瘤胃丁酸濃度過高引起的瘤胃上皮細(xì)胞凋亡有關(guān)尚不明確。本試驗(yàn)通過體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，研究丁酸對瘤胃上皮細(xì)胞生長及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素、ITS、丁酸；DMSO、MTT、Tunel試劑盒、DNA ladder試劑盒、Annexin-V/PI試劑盒；全自動(dòng)酶標(biāo)儀、熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀。

1.2 試驗(yàn)方法

瘤胃上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)：試驗(yàn)動(dòng)物為15日齡湖羊，頸動(dòng)脈放血處死，剪取瘤胃組織用PBS沖洗干凈并用完全培養(yǎng)基帶回實(shí)驗(yàn)室超凈工作臺中，鈍性分離瘤胃上皮，剪碎后用膠原酶和胰蛋白酶進(jìn)行消化處理，收集細(xì)胞懸液接種于含10%胎牛血清、100 EU/mL青鏈霉素、1×ITS的DMEM培養(yǎng)基中，于5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，30 min后將懸液換瓶培養(yǎng)，重復(fù)1次。

待培養(yǎng)的瘤胃上皮原代細(xì)胞長滿約80%～90%，用胰蛋白酶消化5 min，呈單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×103接種于96孔板中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h貼壁后，每孔加培養(yǎng)液100 μL，設(shè)8個(gè)處理，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)，在培養(yǎng)液中分別添加0，20，40，60，80，100，120，140 mmol/L的丁酸，調(diào)節(jié)pH至7.4。于5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于4，6，8，10 h后用于檢測各組細(xì)胞活力。

根據(jù)相對細(xì)胞活力(細(xì)胞相對活力為70%左右)篩選最適宜的丁酸處理設(shè)為丁酸組(普通培養(yǎng)基+適宜濃度丁酸)，與對照組(普通培養(yǎng)基)，采用熒光標(biāo)記法、電泳法、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.3 測定項(xiàng)目和方法

1.3.1 瘤胃上皮細(xì)胞活力的檢測 采用MTT法檢測瘤胃上皮細(xì)胞的細(xì)胞活力。將培養(yǎng)物小心地吸去上清液棄去，用PBS沖洗2～3遍，加普通培養(yǎng)基120 μL(含20 μL 5 mg/mL MTT溶液)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，再每孔加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀上分析，OD490nm處測量各孔的吸光值。將每個(gè)時(shí)間段對照組細(xì)胞活力定義為100%，試驗(yàn)組相對細(xì)胞活力根據(jù)下列公式計(jì)算：

相對細(xì)胞活力(%)=OD試驗(yàn)組/OD對照組×100%

(1)

1.3.2 細(xì)胞凋亡檢測 (1)熒光標(biāo)記法。原代細(xì)胞長滿約80%～90%，消化離心去上清，接種于6孔板加玻璃蓋片進(jìn)行爬片培養(yǎng)，鋪層至80%～90%時(shí)，添加丁酸培養(yǎng)至細(xì)胞活力為70%左右，培養(yǎng)好的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗2 min×3，3%雙氧水室溫處理10 min，PBS洗2 min×3，Proteinase K 37 ℃消化30 s，PBS洗2 min×3，加標(biāo)記緩沖液于濕盒中37 ℃標(biāo)記2 h，PBS洗2 min×3，加封閉液30 min，生物素化抗地高辛抗體于濕盒中37 ℃ 30 min，PBS洗2 min×3，SABC-FITC 37 ℃ 30 min，PBS洗5 min×4，DAPI輕度復(fù)染30 s，PBS洗5 min×3，抗熒光衰減封片劑封片，分別用490 nm和360 nm激發(fā)光照射并在熒光顯微鏡觀察。陰性對照中用PBS替換DIG-dUTP。結(jié)果判定：細(xì)胞核中有黃綠色顆粒者為陽性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞。

(2)電泳法。取對數(shù)生長期的瘤胃上皮細(xì)胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，與丁酸共培養(yǎng)至細(xì)胞活力為70%左右。培養(yǎng)好的細(xì)胞，胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，按DNA ladder試劑盒說明書進(jìn)行操作。電泳后觀察細(xì)胞核酸變化。

(3)流式細(xì)胞術(shù)。取對數(shù)生長期的瘤胃上皮細(xì)胞接種于6孔板中，與丁酸共培養(yǎng)至細(xì)胞活力為70%左右，將細(xì)胞上層培養(yǎng)液去除，PBS洗滌2次，用胰蛋白酶消化細(xì)胞并終止消化，1 000 g離心5 min，PBS清洗1次，用PBS重懸細(xì)胞。制成細(xì)胞懸液，取1×106重懸的細(xì)胞離心后，加入500 μL結(jié)合液輕輕重懸。再加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻，再加入5 μL碘化丙啶，輕輕混勻。 室溫避光孵育10 min。隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，激發(fā)光波長用488 nm，用一波長為515 nm的通帶濾器檢測FITC熒光，另一波長大于560 nm的濾器檢測PI。結(jié)果判定：Annexin和PI雙染陰性為正常細(xì)胞；Annexin陽性，PI陰性為早期凋亡細(xì)胞；Annexin和PI雙染陽性為晚期凋亡細(xì)胞；Annexin陰性，PI陽性為壞死細(xì)胞。早期凋亡和晚期凋亡的細(xì)胞統(tǒng)計(jì)為凋亡細(xì)胞。細(xì)胞凋亡指數(shù)根據(jù)下列公式計(jì)算：

細(xì)胞凋亡指數(shù)(PI)=凋亡細(xì)胞數(shù)/檢測的細(xì)胞總數(shù)×100%

(2)

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 17.0方差分析程序?qū)υ囼?yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)分析采用獨(dú)立樣本單因素分析(One-way ANOVA)和多重比較(Duncan’s)。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果分析

2.1 不同濃度丁酸對瘤胃上皮細(xì)胞活力的影響

MTT法檢測各組和各時(shí)間點(diǎn)的相對細(xì)胞活力，結(jié)果見表1。結(jié)果顯示：各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞活力隨丁酸濃度的增加均呈現(xiàn)先上升后下降趨勢。20，40 mmol/L丁酸處理組在各培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)與對照組差異均不顯著，60～140 mmol/L丁酸處理組均顯著低于對照組。

表1 丁酸對瘤胃上皮相對細(xì)胞活力的影響Tab.1 Effects of butyrate on the relative viability of ruminal epithelial cell %

同列之間比較，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同
Different capital letters in same column mean significant difference at the 0.01 level,and different small letters indicate significant difference at the 0.05 level.The same as bellow

隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，20～40 mmol/L丁酸處理組細(xì)胞活力呈現(xiàn)逐漸提高的趨勢，其中20 mmol/L丁酸處理組在各時(shí)間點(diǎn)均高于對照組(P>0.05)，40 mmol/L丁酸組在培養(yǎng)4～6 h時(shí)降低細(xì)胞活力(P>0.05)，在培養(yǎng)8～10 h時(shí)提高細(xì)胞活力(P>0.05)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，60～120 mmol/L丁酸處理組顯示細(xì)胞活力隨時(shí)間延長先下降后上升，其中60 mmol/L丁酸處理組在培養(yǎng)10 h處提高細(xì)胞活力(P>0.05)，其他各處理組均降低細(xì)胞活力，除80 mmol/L丁酸組10 h處差異不顯著(P>0.01)外，其他各組均達(dá)到了極顯著的差異(P<0.01)。120 mmol/L、140 mmol/L丁酸處理組顯示細(xì)胞活力最低，且兩組間比較差異不顯著(P>0.05)。

2.2 免疫熒光法檢測結(jié)果

根據(jù)上一結(jié)果，選擇較溫和的條件(細(xì)胞相對活力70%左右[11])來觀察細(xì)胞凋亡情況，具體條件為120 mmol/L丁酸，培養(yǎng)6 h。細(xì)胞TUNEL染色檢測結(jié)果見圖1。由圖1可見，丁酸組的上皮細(xì)胞出現(xiàn)大面積脫落，且細(xì)胞“群落”邊緣多為黃綠色標(biāo)記的細(xì)胞；對照組中只有少部分細(xì)胞被標(biāo)記為黃綠色，未有細(xì)胞脫落現(xiàn)象。

A：對照組；B：120 mmol/L丁酸組A:Control group;B:120 mmol/L Butyrate group圖1 熒光標(biāo)記凋亡細(xì)胞的觀察Fig.1 Apoptotic cell marked by fluorescent

M:Marker;A：對照組;B：120 mmol/L丁酸組M:Marker;A:Control group;B:120 mmol/L Butyrate group圖2 電泳法對瘤胃上皮細(xì)胞DNA Ladder的檢測Fig.2 DNA ladder examination of ruminal epithelial cell by electrophoresis analysis

2.3 DNA ladder電泳檢測結(jié)果

DNA ladder電泳檢測結(jié)果見圖2。由圖2可見，120 mmol/L丁酸作用6 h，可見100～500 bp處呈現(xiàn)條帶拖尾現(xiàn)象；對照組在100～500 bp處未見此現(xiàn)象。

2.4 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果見圖3和表2。結(jié)果顯示：120 mmol/L丁酸處理6 h后，相比于對照組的74.2%正常細(xì)胞、9%早期凋亡細(xì)胞和15.1%晚期凋亡細(xì)胞，丁酸組變?yōu)?9.5%正常細(xì)胞，7.8%早期凋亡細(xì)胞和20.6%晚期凋亡細(xì)胞?？梢?，丁酸組減少了早期凋亡的細(xì)胞數(shù)量，增加了晚期凋亡的細(xì)胞數(shù)量，其總凋亡指數(shù)(28.4%)與對照組(24.1%)比較有顯著差異(P<0.05)。

A：對照組；B：120 mmol/L丁酸組A:Control group;B:120 mmol/L Butyrate group圖3 丁酸處理對瘤胃上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)的影響Fig.3 Effects of butyrate on apoptotic index of ruminal epithelial cell

表2 丁酸處理對瘤胃上皮細(xì)胞凋亡的影響Tab.2 Effects of butyrate on apoptotic of ruminal epithelial cells

3 討論結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的丁酸能促進(jìn)瘤胃上皮細(xì)胞生長，而濃度過高的丁酸會抑制細(xì)胞生長，這種抑制作用可能和高濃度丁酸促進(jìn)了瘤胃上皮細(xì)胞凋亡有關(guān)。許多研究表明，短鏈脂肪酸丁酸可供給細(xì)胞能量，是一種有效的腸道保健劑，能促進(jìn)胃腸道上皮細(xì)胞增殖[6-7]。Guilloteau等[12]用3 g/kg丁酸鈉替代黃霉素，發(fā)現(xiàn)丁酸鈉可以提高胃和結(jié)腸中熱休克蛋白HSP27和HSP70濃度，保護(hù)胃腸上皮細(xì)胞，促進(jìn)犢牛胃腸功能成熟。胡衛(wèi)[13]研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)腸腔正常濃度(10 mmol/L)的丁酸鈉，在體外亦有抑制大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡的作用，從而有助于治療潰瘍性結(jié)腸炎。但Siavoshian[14]研究表明，丁酸濃度大于8 mmol/L時(shí)完全抑制人腸道上皮細(xì)胞的生長。這可能是由于不同細(xì)胞對丁酸的耐受程度不同所致。丁酸是瘤胃微生物發(fā)酵的產(chǎn)物之一，是反芻動(dòng)物生長的重要能源[1]。正常情況下，瘤胃內(nèi)丁酸濃度并不高。但在發(fā)生瘤胃酸中毒情況下，丁酸在瘤胃內(nèi)迅速累積，對瘤胃粘膜屏障的結(jié)構(gòu)完整造成破壞[9]。在黃曉忠[15]的研究中，2 mmol/L丁酸鈉能促進(jìn)腸上皮屏障功能，而中、高濃度丁酸鈉(5～8 mmol/L)則刺激p38MAPK的表達(dá)，誘導(dǎo)大量Caco-2細(xì)胞凋亡，破壞細(xì)胞腸屏障功能。Pant[8]也證實(shí)，5 mmol/L的丁酸可抑制組蛋白去乙?；窼IRT-1的表達(dá)，增強(qiáng)活性氧的產(chǎn)生，從而增加肝細(xì)胞凋亡，抑制肝細(xì)胞的生長和增殖。這與本研究結(jié)果相似。

丁酸對瘤胃上皮細(xì)胞生長有影響且存在劑量依賴性。低濃度丁酸(20 mmol/L)對細(xì)胞生長有益，高濃度丁酸(40～140 mmol/L)對細(xì)胞生長有抑制作用。120 mmol/L丁酸培養(yǎng)6 h后誘導(dǎo)了瘤胃上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡。

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