陳 瑤，楊 文，周玉鋒，劉惠芳,楊茂發(fā)

(1.貴州大學(xué) 昆蟲研究所,貴州 貴陽 550025；2.貴州省山地農(nóng)業(yè)病蟲害綜合防治重點實驗室,貴州 貴陽 550025；3.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所,貴州 貴陽 550006)

長期以來，茶樹黑刺粉虱種群和柑橘黑刺粉虱種群均被認(rèn)為是一個種，都以拉丁學(xué)名Aleurocauthusspiuiferus(Quaintance)表示。2010年，Kasai等[1]研究發(fā)現(xiàn)，茶樹黑刺粉虱并不接受柑橘葉片作為寄主。2011年，日本研究人員通過大量的試驗發(fā)現(xiàn)柑橘黑刺粉虱和茶樹黑刺粉虱在成蟲前翅的斑紋數(shù)、生殖器，蛹邊緣蠟狀分泌物的寬度、邊緣細(xì)褶皺數(shù)、乳狀突等10個形態(tài)方面存在明顯差異，并采用線粒體COI基因序列分析鑒定了柑橘黑刺粉虱和茶樹黑刺粉虱，從而證明日本境內(nèi)茶樹上的黑刺粉虱與柑橘黑刺粉虱A.spiniferus(Quaintance) 存在差別，并提出了茶樹上黑刺粉虱種群的新學(xué)名A.camelliaeKanmiya & Kasai和新的俗名為camellia spiny whitefly (茶樹黑刺粉虱)[2-3]。至今，還沒有針對我國境內(nèi)茶樹黑刺粉虱種類鑒定的研究報道，僅2012年胡雅輝等[4]根據(jù)湖南省柑橘黑刺粉虱和茶樹黑刺粉虱線粒體COI基因片段遺傳距離存在明顯的差別，從而推斷出兩種群屬于黑刺粉虱的不同生物型或不同種的Aleurocanthus屬粉虱。貴州省茶樹種植面積列全國第一，茶樹黑刺粉虱在貴州不同茶區(qū)均有發(fā)生，個別茶園近年爆發(fā)成災(zāi)，明確貴州茶園黑刺粉虱的種類，研究其形態(tài)特征為該蟲的發(fā)生監(jiān)測及防治提供理論依據(jù)。為明確貴州茶樹黑刺粉虱的種類，本文采用線粒體COI基因的DNA條形碼技術(shù)和形態(tài)特征相結(jié)合的方法，開展了貴州茶樹黑刺粉虱的鑒定，為茶樹黑刺粉虱的科學(xué)防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 貴州省茶樹黑刺粉虱的分子鑒定

1.1.1 采樣地點 本實驗所用的黑刺粉虱是2015—2016年采自貴州10個產(chǎn)茶縣共12個不同地點的茶園，采樣點信息見表1。實驗所用蟲態(tài)均為蛹或若蟲。采集時，用撥針將茶樹葉片上的黑刺粉虱蛹或若蟲撥下直接浸泡于1.5 mL裝有無水乙醇的離心管中，帶回實驗室后保存在-20 ℃冰箱中備用。

表1 采樣地信息Tab.1 General informations for sampling

1.1.2 實驗方法 (1)黑刺粉虱DNA的提取。在-20 ℃冰箱保存的離心管中，取10頭偽蛹或若蟲，單頭提取DNA，提取方法按照參考文獻(xiàn)[3]的方法。(2)茶樹黑刺粉虱引物的設(shè)計與合成。擴(kuò)增黑刺粉虱mtCOI基因的引物為參考文獻(xiàn)[3]述及的茶樹黑刺粉虱特異性引物。引物序列分別為：

上游引物AsFcha：5′-ATTTCACACTTAATTAGGAGTGA-3′

下游引物AsR4cha：5′-CTGCACGAAATACAACAAATGC-3′

PCR反應(yīng)總體積50 μL反應(yīng)體系，各組分如下：模板DNA 1 μL，10PCR Buffer 5 μL，2.5 mmol/L MgCL25 μL，dNTP(10 mmol/L)1 μL，引物AsFcha和AsR4cha(20 μmol/L)各1 μL，TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.5 μL，ddH2O 35.5 μL，所用材料均購自生物工程上海(股份)有限公司。PCR擴(kuò)增在PTC-200型擴(kuò)增儀上完成，程序為95 ℃預(yù)變性3 min，然后94 ℃ 30 s，60 ℃退火35 s，72 ℃延伸1 min，35次循環(huán)，72 ℃延伸5 min。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳結(jié)束后在紫外光下檢測結(jié)果并拍照。所得目的片段送生物公司采用PCR產(chǎn)物直接雙向測序。(3)數(shù)據(jù)分析。測序結(jié)果與Kanmiya等[2]研究結(jié)果的COI基因片段比對，用MEGA 6.0軟件[5]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，建樹方法為基于Kimura 2模型的最大似然法[6]，系統(tǒng)樹各分支置信度用Boostrap 1 000次重復(fù)檢驗。

1.2 貴州省茶樹黑刺粉虱的形態(tài)特征觀察

按照參考文獻(xiàn)[2]的方法，采集貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶園中茶樹黑刺粉虱的成蟲、卵、若蟲和蛹，采用超景深三維顯微系統(tǒng)(KEYENCE VHX-5000)進(jìn)行形態(tài)觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 貴州省茶樹黑刺粉虱的分子鑒定

利用MEGA6基于最大似然法、Kimura 2模型構(gòu)建進(jìn)化樹，分支處上方的值是重復(fù)1 000次后自展值The phylogenetic tree was conducted by using the Maximum Likelihood method based on the Kimura 2-parameter model in MEGA6 with 1 000 bootstrap replicates圖1 黑刺粉虱系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Molecular phylogenetic tree of Aleurocanthus sp.

本研究用來構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹的COI基因序列共36條，其中12條是采自貴州省茶園蟲樣的序列，其編號見表1，13條來自NCBI上已公布的茶樹黑刺粉虱種群(登錄號分別為AB536794、AB536795、AB536796、AB536797、AB536798、AB536799、AB536800、AB615363、LC088497、AB786712、AB786713、AB786714和KJ437166)，3條來自柑橘黑刺粉虱種群(登錄號為AB536792、AB536793和AB558172)，此外還包括來自Aleurotracheluscamelliae(AB536801)、Aleurocanthusbangalorensis(KY624597)、Aleurocanthuscitriperdus(HM150620)、Aleurocanthusinceratus(HM150621)、Aleurocanthuswoglumi(JX281760)、Aleurocanthussp.9WZ-2010 (HM150622)、Aleurocanthussp.BIOUG02542-C05(KY835557)、Aleurocanthussp.BIOUG02542-E07(KY836994)的各1條序列。將所有序列在Clustalx軟件上進(jìn)行多序列比對，然后利用MEGA 6.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建(圖1)。 采自于貴州省12個不同茶園的黑刺粉虱與已明確鑒定的13個茶樹黑刺粉虱A.camelliae聚在了同一個亞組，且明顯區(qū)分于日本柑橘的黑刺粉虱A.spiniferus。此外，利用DNAMAN軟件對貴州的12個樣品序列與KJ437166的上述引物間序列進(jìn)行比對，12個樣品間序列高度相似，且與KJ437166的序列同樣具有高度相似性。

2.2 貴州省茶樹黑刺粉虱的形態(tài)特征

2.2.1 成蟲 成蟲體長1.10～1.79 mm，寬0.52～0.73 mm；頭胸部暗褐色，覆白色蠟粉；復(fù)眼紅色；腹部橙黃色；前翅由淺棕色變成紫褐色，覆白色蠟粉，上有9個不規(guī)則白色斑紋；后翅淡紫褐色，無白色斑紋；足黃色，腿節(jié)和基節(jié)微黃色，然后變成淺棕色，深棕色，前足顏色較中足、后足淡，也覆有白色蠟粉；觸角4～7節(jié)，黃色(圖2)。

A：成蟲背面；B：成蟲腹面；C,D：成蟲側(cè)面；E：初羽化成蟲前翅，具9個不規(guī)則白色斑紋；F：成蟲前翅，具9個不規(guī)則白色斑紋；G：成蟲后翅A：adult,dorsal view;B：adult,abdominal view;C,D：adult,lateral view;E：the early adult fore-wings,with 9 white maculae irregular white markings;F：fore wing of adult,with 9 white maculae irregular white markings;G：hind wing of adult圖2 茶樹黑刺粉虱成蟲Fig.2 Adult photomicrographs of A.camelliae

2.2.2 卵 卵長約0.14～0.17 mm，寬0.08～0.10 mm，長橢圓形，稍彎曲，頂部較尖，基部鈍圓，有一短柄固著在葉背上，初產(chǎn)時乳白色、淡黃色，后漸變黃褐色、黑褐色(圖3)。

2.2.3 若蟲 若蟲共4齡，呈橢圓形，初孵若蟲無色透明，能爬行，固定后很快變成黑色，有光澤，各齡若蟲均在體軀周圍分泌一圈白色蠟質(zhì)物。一齡若蟲：體長0.24～0.30 mm，寬0.10～0.14 mm，橢圓形，體背有6根淺色刺毛，邊緣出現(xiàn)白色蠟質(zhì)物，并逐漸加寬(圖4)。

二齡若蟲：體長0.35～0.43 mm，寬0.20～0.27 mm，胸部分節(jié)不明顯，腹部分節(jié)明顯，頭胸部6對刺毛，腹部側(cè)背面4對刺毛，其中以胸部中間2對最長(圖5)。

A：初產(chǎn)卵乳白色；B：卵后期變成黑褐色；C,D：卵具一短柄；E-G：孵化后具明顯孔口的卵殼A：newly deposited eggs pale;B：the egg turns brown to darker before hatching;C,D：the egg has a short stalk;E-G：the egg shell has a obvious orifice after hatching圖3 茶樹黑刺粉虱卵Fig.3 ovum photomicrographs of A.camelliae

A：邊緣局部初現(xiàn)白色蠟質(zhì)物；B：邊緣四周初現(xiàn)白色蠟質(zhì)物；C：邊緣白色蠟質(zhì)物逐漸加寬A：the edge is surrounded by white marginal waxy partially；B：the edge is surrounded by white marginal waxy；C：the edge of white waxy is gradually widened圖4 茶樹黑刺粉虱一齡若蟲 Fig.4 1st-instar nymph photomicrographs of A.camelliae

三齡若蟲：體長0.52～0.69 mm，寬0.33～0.43 mm，腹部前半分節(jié)不明顯，但胸節(jié)分界明顯；體背具長短刺毛14對(胸部前方1對短毛不計)，背部附有1個三角形的若蟲蛻皮殼(圖6)。

四齡若蟲近似三齡若蟲，體長0.78～1.29 mm，寬0.52～0.77 mm，背部附有2個重疊的三角形若蟲蛻皮殼(圖7)。

A：正面圖；B：側(cè)面圖 A：positive view;B：lateral view圖5 茶樹黑刺粉虱二齡若蟲 Fig.5 Photomicrographs of 2nd-instar nymph A.camelliae

圖6 三齡若蟲Fig.6 3rd-instar nymph

2.2.4 蛹 蛹長0.90～1.32 mm，寬0.50～0.89 mm，橢圓形，漆黑色，有光澤，邊緣成鋸齒狀，周圍有較寬的白色蠟邊，背面顯著隆起，背盤區(qū)胸部有長短刺毛9對，腹部10對；邊緣雌蛹有長短刺毛 11對，雄蛹10對，且向上豎立(圖8)。

圖7 四齡若蟲Fig.7 4th-instar nymph

3 討論與結(jié)論

3.1 茶樹黑刺粉虱類群COI基因

韓敏[7]通過mtDNA-COI基因序列分析了全國22個黑刺粉虱不同地理種群的遺傳差異；根據(jù)mtDNA-COI基因序列，采用3種方法構(gòu)建了系統(tǒng)樹，其結(jié)果表明黑刺粉虱不同地理種群之間親緣關(guān)系與地理分布存在一定相關(guān)性。胡雅輝等[4]通過mtDNA-COI基因序列分析了湖南20個黑刺粉虱種群遺傳距離，根據(jù)其mtDNA-COI基因序列建立的系統(tǒng)樹，柑橘黑刺粉虱種群和茶園黑刺粉虱種群之間的遺傳距離明顯高于柑橘黑刺粉虱不同地理種群之間的遺傳距離，也明顯高于茶園黑刺粉虱不同地理種群之間的遺傳距離。由此推斷柑橘黑刺粉虱和茶園黑刺粉虱屬于黑刺粉虱的不同生物型，或不同種的Aleurocanthus屬粉虱。Kanmiya等[2]通過mtDNA-COI基因序列分析了日本11個黑刺粉虱種群遺傳距離，根據(jù)建立的系統(tǒng)樹，來自日本8個地區(qū)的茶樹黑刺粉虱種群聚為一大類，來自日本3個地區(qū)的柑橘黑刺粉虱種群聚為一大類，兩種群之間差別明顯。Chen等[8]研究了柑橘黑刺粉虱完整COI基因?qū)ζ湎到y(tǒng)發(fā)育的影響，在文章中并未對柑橘黑刺粉虱和茶園黑刺粉虱進(jìn)行區(qū)分，兩者的學(xué)名任是統(tǒng)一沿用A.spiniferus。

本研究對采自于貴州省10個茶區(qū)共12個茶樹黑刺粉虱進(jìn)行了分子鑒定，將測試的貴州省12條不同茶園的mtDNA-COI基因序列進(jìn)行序列比對，結(jié)果顯示這些序列彼此間高度相似，表明這12個樣品很有可能屬于同一個種群；此外，系統(tǒng)聚類分析顯示它們與已確認(rèn)的13個茶樹黑刺粉虱A.camelliae聚在了同一個亞組，且明顯區(qū)分于日本柑橘黑刺粉虱A.spiniferus[2]，表明這12個樣品屬于茶樹黑刺粉虱類群。另外，在NCBI上，登錄號為KJ437166的是Aleurocanthusspiniferus的線粒體基因組序列，對貴州的12個樣品以及KJ437166的引物間序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示這些序列間高度相似，同時結(jié)合系統(tǒng)進(jìn)化結(jié)果，KJ437166應(yīng)屬于Aleurocanthuscamelliae。

3.2 茶樹黑刺粉虱形態(tài)特征的相關(guān)描述

2011年以前，國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)所報道的茶樹黑刺粉虱均一直沿用柑橘黑刺粉虱的學(xué)名A.spiniferus(Quaintance)。2010年至2011年，日本研究人員證明日本境內(nèi)茶樹上的黑刺粉虱與柑橘黑刺粉虱A.spiniferus(Quaintance) 存在差別，并明確了茶樹上黑刺粉虱種群的新學(xué)名A.camelliaeKanmiya & Kasai[2-3]。

在我國，對茶樹上黑刺粉虱形態(tài)特征進(jìn)行觀察和描述的最早報道時間是1979年[9]；靳永等[10]在解剖鏡或光學(xué)顯微鏡下觀察了黑刺粉虱形態(tài)特征，其所用種名是A.spiniferus(Quaintance)。至今，我國還沒有針對我國境內(nèi)茶樹黑刺粉虱的鑒定研究，僅是2012年胡雅輝等[4]根據(jù)湖南省柑橘黑刺粉虱和茶樹黑刺粉虱線粒體COI基因片段遺傳距離存在明顯的差別，從而推斷出兩種群屬于黑刺粉虱的不同生物型或不同種的Aleurocanthus屬粉虱[4]。

Kanmiya等[2]根據(jù)將其所觀察的茶樹黑刺粉虱A.camelliae的形態(tài)特征與柑橘黑刺粉虱A.spiniferus的形態(tài)特征進(jìn)行對比，找出蛹和成蟲共10個形態(tài)特征有差異，其中最易區(qū)別的是成蟲的前翅，A.spiniferus前翅有7個白斑，而A.camelliae有9個。國內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)報道的各個蟲態(tài)的形態(tài)特征中，所描述的成蟲前翅上均為7個不規(guī)則白色斑紋[9-10]。國內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)所描述的卵形態(tài)特征與Kanmiya等的觀察描述大同小異；但是各齡若蟲分齡及其體背刺毛數(shù)量和蛻皮殼數(shù)量的主要特征觀察描述各異，且與Kanmiya等的觀察描述不盡相同[9-10]。

本研究成蟲前翅上有9個不規(guī)則白色斑紋的觀察結(jié)果與Kanmiya等[2]觀察的茶樹黑刺粉虱類群相同，但明顯區(qū)別于國內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)所描述的成蟲前翅上均為7個不規(guī)則白色斑紋。在本研究卵、若蟲和蛹3個蟲態(tài)的重要形態(tài)特征中，卵的顏色變化為初產(chǎn)時乳白色、淡黃色，后漸變黃褐色、黑褐色；一齡若蟲體背有6根淺色刺毛，二齡若蟲體背有10對刺毛，三齡若蟲體背具14對刺毛且背部附有1個三角形的若蟲蛻皮殼，四齡若蟲體背具14對刺毛且背部附有2個重疊的三角形若蟲蛻皮殼。這些形態(tài)特征的觀察結(jié)果與Kanmiya等[2]的觀察描述一致。因此，本研究形態(tài)觀察結(jié)果中，各蟲態(tài)的相關(guān)形態(tài)特征與國內(nèi)相關(guān)報道的描述不盡相同，但與日本Kanmiya等[2]報道的A.camelliae的形態(tài)特征描述一致。

通過分子鑒定和形態(tài)觀察結(jié)果表明，貴州茶區(qū)茶樹黑刺粉虱與日本學(xué)者Kanmiya 等的研究結(jié)果一致，新學(xué)名應(yīng)為已報道的A.camelliaeKanmiya & Kasai。本研究僅明確了貴州茶區(qū)黑刺粉虱種類，但是全國各大茶區(qū)黑刺粉虱的鑒定至今未見報道，因此，全國范圍內(nèi)茶樹黑刺粉虱種群的鑒定有待開展。

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