趙燕 木胡牙提·烏拉斯?jié)h 楊玉春 何鵬義 劉志強(qiáng) 張雷

心房顫動(dòng)(簡(jiǎn)稱房顫)患者的抗凝治療非常重要，目前華法林使用最為廣泛，有研究報(bào)道載脂蛋白E(ApoE)基因多態(tài)性與西方人群華法林用量個(gè)體差異有一定影響[1-2]，國(guó)內(nèi)也有相似研究證實(shí)ApoE基因多態(tài)性與華法林劑量存在聯(lián)系[3]，但國(guó)內(nèi)尚無維吾爾族ApoE基因多態(tài)性與華法林劑量相關(guān)性的研究。通過大量查閱英文文獻(xiàn)，ApoE基因影響維生素K的攝取，在美國(guó)生物技術(shù)信息中心的單核苷酸多肽性(SNP)數(shù)據(jù)庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP)登錄ApoE基因人類SNP 找ApoE全基因序列及rs號(hào)及其突變位點(diǎn),可以使用國(guó)際人類基因組單體型圖計(jì)劃網(wǎng)站(http：//hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/index.html.en)來確定ApoE基因的標(biāo)簽SNP，查國(guó)內(nèi)外與ApoE基因SNP位點(diǎn)多態(tài)性有關(guān)的文獻(xiàn)確定rs位點(diǎn)為rs429358。本研究探討新疆維吾爾族ApoE rs429358位點(diǎn)基因型的分布情況及房顫患者口服華法林的有效劑量。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象 納入標(biāo)準(zhǔn)：①選取2014年 7 月至2016 年 7月在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診的長(zhǎng)居新疆地區(qū)的維吾爾族房顫患者100例。② 經(jīng)體表心電圖或動(dòng)態(tài)心電圖檢測(cè)后確診為房顫患者。③口服華法林并且使用華法林抗凝治療已經(jīng)超過3個(gè)月，并已達(dá)到穩(wěn)定維持劑量，即國(guó)際化標(biāo)準(zhǔn)比率(INR)已達(dá)標(biāo)者(根據(jù)歐美指南建議選取INR在 2.0～3.0 之間的房顫患者)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①血液疾病或出血傾向；②血小板計(jì)數(shù)<120×109/ L; ③心力衰竭(紐約心功能分級(jí)3或4級(jí));④肝功能障礙(定義為慢性肝病的存在或顯著肝損傷的生化證據(jù));⑤腎功能障礙(定義為慢性透析或血清肌酐>200 mmol/L或腎移植受者); ⑥甲狀腺疾病; ⑦惡性腫瘤; ⑧消化性潰瘍; ⑨感染; ⑩自身免疫疾病;懷孕;除外家族性房顫發(fā)病；排除瓣膜性心臟病、先天性心臟病、肺部疾病、甲狀腺功能亢進(jìn)等疾病患者；選擇同期就診本院體檢中心體檢的維吾爾族非房顫人群(除外合并高血壓病、冠心病、心臟外科手術(shù)、瓣膜病、心力衰竭、心肌病、先天性心臟病、肺動(dòng)脈栓塞、甲狀腺功能亢進(jìn)癥等，與飲酒、精神緊張、水電解質(zhì)紊亂、嚴(yán)重感染等疾病的)100例作為對(duì)照組；本研究通過本院臨床研究中心倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)，所有研究者均簽署知情同意書。

1.2臨床數(shù)據(jù) 通過調(diào)取本院病歷系統(tǒng)進(jìn)行病例回顧，收集受試者的臨床資料，包括年齡、性別、身高、體重、INR值穩(wěn)定在2～3之間、華法林劑量、伴隨疾病、口服的相互影響的藥物、吸煙狀況、體重指數(shù)等指標(biāo)。

1.3樣本采集與DNA提取 清晨抽取受檢者外周靜脈血2 ml 裝入有EDTA抗凝劑的試管。通過標(biāo)準(zhǔn)酚-氯仿法提取基因組DNA，核酸蛋白分析儀(Eppendorf Biophotometer)檢測(cè)DNA濃度和純度，OD260/OD280>1.7,說明DNA純度合格。合格的DNA加入TE液后于-20℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4引物設(shè)計(jì) 由Genebank 中查找目的基因序列后對(duì)其進(jìn)行核對(duì)，由寶生物工程(大連)有限公司合成，用DNAMAN軟件分析，并經(jīng)檢測(cè)無發(fā)夾結(jié)構(gòu)，無二聚體形成，生工生物工程(上海)有限公司合成。ApoE基因 rs429358位點(diǎn)引物序列如下：(5′-3′)上游引物： 5′_CACTGTGCGACACCCTCC_3′；下游引物：5′_TTCTGCAGGTCATCGGCATC_3′；退火溫度為60℃，產(chǎn)物長(zhǎng)度為300 bp左右。

1.5聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增 設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增包含 ApoE rs429358位點(diǎn)的片段。經(jīng)過對(duì)條件摸索后，最終摸索條件時(shí)的溫度、梯度和PCR條件為：25μl PCR C1000TM Thermal Cycler(PTC-200型PCR擴(kuò)增儀)上進(jìn)行反應(yīng)體系含：PCR Mastermix(2x)25μl，上、下游引物各 0.5 pmol， dd2O9.5μl，基因組DNA 2μl。循環(huán)參數(shù)：95℃ 預(yù)變性 5 min，95℃ 變性 30 s、60℃退火 45 s,72℃ 延伸45 s,共35個(gè)循環(huán)；最后72℃ 總延伸5 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取 6μl擴(kuò)增產(chǎn)物在 1.5%～2.0%瓊脂糖凝膠上電泳，觀察 PCR產(chǎn)物的特異性和片斷大小。

1.6酶切及分型鑒定 ApoE基因rs429358位點(diǎn)的酶切體系：酶切總體積：20 μl；①限制性核酸內(nèi)切酶的選擇以及用量：HhaI 0.8 μl;②PCR擴(kuò)增產(chǎn)物：10 μl；③10×bufferR：2 μl；④ddH2O：7.2 μl；⑤酶切溫度：37℃； 時(shí)間：16 h過夜；2%瓊脂糖凝膠電泳分析酶切產(chǎn)物：取15 μl 酶切產(chǎn)物加入 2%瓊脂糖凝膠負(fù)極端的加樣孔，在180 V電壓下電泳45 min，在紫外線燈下觀察帶型。將PCR產(chǎn)物與DNA片段長(zhǎng)度標(biāo)準(zhǔn)物用Marker比對(duì)鑒定基因型。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。通過Hardy-Weinberg平衡分析，確定研究樣本的群體代表性。ApoE基因等位基因頻率和基因型頻率采用基因計(jì)數(shù)法，計(jì)數(shù)資料以%表示，基因型及等位基因頻率比較采用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05。計(jì)量資料的比較采用兩樣本均數(shù)比較的t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1兩組一般資料的比較 房顫組年齡大于對(duì)照組；身高、血壓、甘油三酯、低密度脂蛋白等均無差異(表1)。

2.2Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗(yàn) 所選人群ApoE基因 rs429358位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率分布均符合Hardy-Weinberg 平衡，說明該樣本具有人群代表性 (表2)。

2.3ApoE基因 rs 429358位點(diǎn)基因多態(tài)性 ApoE由位于一個(gè)基因位點(diǎn)上的三個(gè)等位基因所控制，即E2、E3和E4, 產(chǎn)生三種純合子(E2/2，E3/3，E4/4)和三種雜合子(E2/3，E2/4，E3/4)共六種, 依次為38,16,19,72,18,48和33 bp,其中38,16和18 bp片斷是所有ApoE基因型共有的，E2在112位和158位均為-GTGC-,不能被HhaI酶切，所得的片斷依次為38,16,91,18和81 bp，E3在112為-GTGC-,不能被HhaI酶切，所得的片斷依次為38,16,91,18，48和33bp，本實(shí)驗(yàn)得出的產(chǎn)物長(zhǎng)度為300 bp左右，包含目的片段；共檢出6種基因型(圖1及圖2)。

表1 兩組一般資料的比較

表2 Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗(yàn)

圖1 ApoE基因 rs 429358位點(diǎn) PCR產(chǎn)物電泳圖

2,4,6,10,11,12,15,17 E3/E3基因型; 1為E2/E2基因型; 3為E3/E4基因型; 13，16為E3/E4基因型; 7為非酶切基因; 8為E2/E2基因型; E2/E3基因型為5,9; 14為E2/E4基因型

2.4ApoE基因 rs429358位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率分布 共檢出3種等位基因和6種基因型；E2/E2、E2/E3、E2/E4、E3/E3、E3/E4和E4/E4六種基因型頻率分別為：0.5%、8%、1.5%、73.5%、14%、2.5%；E2、E3、E4的等位基因型比例為8.5%、75%、16.5%，房顫組與對(duì)照組比無差異(P>0.05),見表3。

表3 新疆ApoE基因rs429358位點(diǎn)基因型及等位基因分布

2.5基因型與華法林劑量之間的比較 房顫組華法林穩(wěn)定劑量范圍是 1.25～4.5 mg/d, 平均劑量為(2.438±0.563)mg/d。由于E2/E2、E2/E4和E4/E4三種基因型病例數(shù)太少，無法進(jìn)行對(duì)比，故只研究E2/E3、E3/E4與E3/E3三者之間有無差異。E2/E3基因型華法林劑量高于E3/E3，E3/E4基因型華法林的劑量低于E3/E3，兩兩比較，無差異見表4。

表4 各基因型的華法林穩(wěn)定劑量/(mg/d)

3 討論

近年來心血管藥物基因?qū)W與臨床應(yīng)用越來越受關(guān)注,某些國(guó)家已經(jīng)開展了華法林劑量算法相結(jié)合的基因多態(tài)性遺傳與臨床因素估算華法林初始劑量[4-5]。比較標(biāo)準(zhǔn)劑量華法林初始劑量基因?qū)蛐燥L(fēng)險(xiǎn)-效益，證明基因?qū)虻哪Ｊ娇赡軙?huì)降低出血事件[6]。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局2007年修訂后的藥物說明和2010年將遺傳信息VKORC1、CYP2C9來臨床指導(dǎo)華法林抗凝治療[7-8]。

載脂蛋白E是一種富含精氨酸的堿性蛋白，人ApoE是由299個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為34145D，其合成是由位于一個(gè)基因位點(diǎn)上的三個(gè)等位基因所控制，即E2、E3和E4，產(chǎn)生三種純合子(E2/2，E3/3，E4/4)和三種雜合子(E2/3，E2/4，E3/4)共六種常見表型[9-11]，不同的載脂蛋白E亞型具有不同的親和力和低密度脂蛋白受體，維生素K的乳糜微粒殘余肝臟清除不同ApoE亞型之間，E2

本研究中，基本資料顯示年齡是房顫的危險(xiǎn)因素，也就是說隨著年齡增加，房顫的患病率隨之增高[15]，與既往國(guó)內(nèi)研究基本一致。這可能與老年人暴露在其他危險(xiǎn)因素的機(jī)會(huì)增加有關(guān)，此外年齡增長(zhǎng)的同時(shí)常常伴有多重、復(fù)雜的心臟結(jié)構(gòu)及電活動(dòng)的改變，包括竇房結(jié)結(jié)節(jié)狀纖維的逐級(jí)喪失和纖維化、脂肪組織的逐漸增多，以及由于左室順應(yīng)性逐漸下降所引起的左房擴(kuò)大，都會(huì)誘發(fā)房顫的發(fā)生。故在新疆存在研究?jī)r(jià)值，新疆維吾爾族房顫患者ApoE基因rs 429358位點(diǎn)基因多態(tài)性及與華法林穩(wěn)定劑量差異性研究；①新疆地區(qū)維吾爾族人群ApoE基因 rs429358位點(diǎn)的六種基因型頻率分別為：0.5%、8%、1.5%、73.5%、14%、2.5%；維吾爾族ApoE基因 rs429358位點(diǎn)的等位基因型比例為8.5%、75%、16.5%;與國(guó)內(nèi)黃勝文等研究相類似[16]；與國(guó)內(nèi)的云南白族[17]人群相對(duì)比，本研究中的E4等位基因比例稍高，與桂西壯族[18]人群的ApoE基因多態(tài)性相對(duì)比，本研究的E2基因型偏高，維吾爾族房顫患者E2/E3、E3/E4與E3/E3三者基因型相比，使用有效華法林劑量具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；故ApoE基因型不同可能口服的有效華法林劑量存在差異。

ApoE基因rs 429358位點(diǎn)可作為房顫患者針對(duì)華法林穩(wěn)定劑量預(yù)測(cè)個(gè)體差異性的指標(biāo)之一。由于不同個(gè)體間華法林穩(wěn)定劑量可相差20倍以上，在常規(guī)劑量下， 容易發(fā)生血栓形成或出血事件等副作用。 故患者在口服華法林抗凝治療前，應(yīng)考慮基因多態(tài)性，嚴(yán)格執(zhí)行個(gè)體化用藥不僅可使患者迅速得到有效的治療效果，還能減少出血或者血栓的事件發(fā)生，提高華法林臨床應(yīng)用的安全性和有效性。

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