宋蘊(yùn)薇，仇雪梅，陸森，樊紅

(1. 東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 遺傳與發(fā)育生物學(xué)系，江蘇 南京 210009； 2. 江蘇省中醫(yī)藥研究院，江蘇 南京210028； 3. 棗莊市婦幼保健院，山東 棗莊 277100； 4. 江蘇省人民醫(yī)院，江蘇 南京 210029)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)慢性感染是我國(guó)HCC重要的致病因素之一[1]。HBx基因是HBV病毒基因組中最小的開(kāi)放性閱讀框，其蛋白作為多功能蛋白，廣泛參與病毒的復(fù)制、宿主細(xì)胞的基因調(diào)控和表達(dá)等過(guò)程[2]。在HBx致肝癌發(fā)生的研究中發(fā)現(xiàn)，HBx可以通過(guò)上調(diào)DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)的表達(dá)使抑癌基因的啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生甲基化從而抑制其表達(dá)[3]。

RAS相關(guān)結(jié)構(gòu)域家族1A(RASSF1A)是近年發(fā)現(xiàn)的一個(gè)重要抑癌基因。其啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化引起的基因失活，與多種癌癥的發(fā)展有關(guān)[4-6]。HBx可能通過(guò)激活DNMT1的表達(dá)[7]，造成RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化狀態(tài)改變致其失活，參與肝癌的發(fā)生和發(fā)展。本研究分析了肝細(xì)胞永生化細(xì)胞系及HCC細(xì)胞系中HBx的表達(dá)水平與RASSF1A基因表達(dá)水平之間的相關(guān)性，進(jìn)而分析HBx對(duì)RASSF1A表達(dá)抑制的可能機(jī)制以及RASSF1A基因的低表達(dá)是否受其啟動(dòng)子區(qū)甲基化的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系

正常肝細(xì)胞永生化細(xì)胞系L02、Chang liver，HCC癌旁細(xì)胞系QSG-7701，HCC細(xì)胞系SMMC-7721、BEL-7405、MHCC-97H、MHCC-97L、HepG2，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBV病毒的HCC細(xì)胞系HepG2.2.15，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBx基因的正常肝細(xì)胞永生化細(xì)胞系L02-X1#1、L02-X1#8及轉(zhuǎn)染空白載體的對(duì)照細(xì)胞系L02-TR#19。

1.2 RT-PCR及qPCR

抽提細(xì)胞系的總RNA，以制備cDNA第一鏈，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所用引物如下：β-肌動(dòng)蛋白：正向引物5′-AAAGACCTGTACGCCAACAC-3′，反向引物5′-GTCATACTCCTGCTTGCTGAT-3′；RASSF1A：正向引物5′-TCATCTGGGGCGTCGTG-3′，反向引物5′-CGTTCGTGTCCCGCTCC-3′；HBx：正向引物5′-GACGTCCTTTGTCTACGTCC-3′，反向引物5′-GTCATACTCCTGCTTGCTGAT-3′;DNMT1：正向引物5′-CCGAGTTGGTGATGGTGTGTAC-3′，反向引物5′-AGGTTGATGCTGCGTGGTAGC-3′。

1.3 轉(zhuǎn)染細(xì)胞系

HCC癌旁細(xì)胞系QSG-7701、HCC細(xì)胞系SMMC-7721中轉(zhuǎn)染HBx基因構(gòu)建細(xì)胞模型QSG-7701-X1(轉(zhuǎn)染了HBx全長(zhǎng)基因表達(dá)載體)、QSG-7701-X2(轉(zhuǎn)染了HBx截短序列表達(dá)載體)、轉(zhuǎn)染空白載體的對(duì)照細(xì)胞系QSG-7701-空白對(duì)照、SMMC-7721-X1(轉(zhuǎn)染了HBx全長(zhǎng)基因表達(dá)載體)、SMMC-7721-X2(轉(zhuǎn)染了HBx截短序列表達(dá)載體)及轉(zhuǎn)染空白載體的對(duì)照細(xì)胞系SMMC-7721-空白對(duì)照；建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染DNMT1 siRNA載體的HCC細(xì)胞系SMMC-7721-DNMT1 siRNA，及其對(duì)照細(xì)胞系SMMC-7721-DNMT1。

1.4 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜胞苷(5′-aza)處理細(xì)胞

將攜有HBx基因的HCC細(xì)胞系MHCC-97H培養(yǎng)至匯合率30%時(shí)，分別以含有0、5、10、25及50 μmol·L-1的5′-aza RPMI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，更換為正常的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h使細(xì)胞回復(fù)生長(zhǎng)。

1.5 亞硫酸氫鹽基因組測(cè)序(bisulfite genomic sequencing, BGS)

將用亞硫酸氫鹽法修飾純化過(guò)的DNA為模板，以半巢氏PCR方式擴(kuò)增，引物分別為：MU379：5′-GTTTTGGTAGTTTAATGAGTTTAGGTTTTTT-3′； ML730：5′-ACCCTCTTCCTCTAACACAATAAAACTAACC-3′；ML561：5′-CCCCACAATCCCTACACCCAAAT-3′。其中MU379和ML730行第1輪PCR擴(kuò)增，MU379和ML561行第2輪PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物連接轉(zhuǎn)化入感受態(tài)的DH5α大腸桿菌中，挑取單克隆菌落，培養(yǎng)后進(jìn)行菌液PCR，取8個(gè)陽(yáng)性克隆過(guò)夜培養(yǎng)后菌液送華大基因公司測(cè)序。

2 結(jié) 果

2.1 RASSF1A在HCC細(xì)胞系中表達(dá)水平分析

在正常肝細(xì)胞永生化細(xì)胞系L02、Chang liver，HCC癌旁細(xì)胞系QSG-7701，HCC細(xì)胞系SMMC-7721、BEL-7405、MHCC-97H、MHCC-97L、HepG2與HepG2.215中，應(yīng)用RT-PCR與qPCR方法檢測(cè)RASSF1A的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常肝細(xì)胞永生化細(xì)胞系L02、Chang liver和HCC癌旁細(xì)胞系QSG-7701相比，RASSF1A在HCC細(xì)胞系SMMC-7721、BEL-7405、MHCC-97H、MHCC-97L、HepG2和HepG2.215中的表達(dá)水平明顯降低，且在MHCC-97H、MHCC-97L和HepG2.215細(xì)胞中均可檢測(cè)出HBx的表達(dá)(圖1A、B)。

圖1RASSF1A及HBx基因在HCC細(xì)胞系中的表達(dá)分析
A.qPCR方法檢測(cè)RASSF1A在HCC細(xì)胞系中的表達(dá)水平； B.RT-PCR結(jié)果顯示RASSF1A及HBx在HCC細(xì)胞系中的表達(dá)水平

Fig1ExpressionanalysisofRASSF1AandHBxinHCCcelllines

2.2 HBx基因表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染抑制了RASSF1A基因的表達(dá)

與轉(zhuǎn)染對(duì)照空載體的L02-X1#19細(xì)胞系相比，RASSF1A在轉(zhuǎn)染HBx基因全長(zhǎng)表達(dá)載體細(xì)胞系L02-X1#8中表達(dá)水平下降(圖2A)。在轉(zhuǎn)染HBx基因全長(zhǎng)的細(xì)胞系QSG-7701-X1、SMMC-7721-X1及轉(zhuǎn)染HBx截短序列的細(xì)胞系QSG-7701-X2中，RASSF1A的表達(dá)水平亦存在下降趨勢(shì)(圖2B)。

圖2HBx基因的導(dǎo)入影響了RASSF1A的表達(dá)水平
A.轉(zhuǎn)染HBx表達(dá)載體的L02細(xì)胞系中RASSF1A的表達(dá)變化； B.轉(zhuǎn)染HBx表達(dá)載體的QSG-7701和SMMC-7721細(xì)胞系中RASSF1A的表達(dá)變化

Fig2ThetransformationofHBxaffectedtheexpressionlevelofRASSF1A

2.3 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5′-aza使RASSF1A基因出現(xiàn)回復(fù)表達(dá)

為了檢測(cè)HCC細(xì)胞中RASSF1A的表達(dá)水平是否受DNA甲基化的影響，本研究在表達(dá)HBx基因的HCC細(xì)胞系MHCC-97H中行濃度梯度式5′-aza處理。提取處理組總RNA，以RT-PCR檢測(cè)RASSF1A表達(dá)水平，結(jié)果顯示，MHCC-97H細(xì)胞系中，5′-aza的處理升高了RASSF1A的表達(dá)水平，且表現(xiàn)為RASSF1A的表達(dá)水平與5′-aza的處理劑量的依賴關(guān)系(圖3A)。

圖3干預(yù)DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)與活性影響了RASSF1A的表達(dá)水平
A.RT-PCR檢測(cè)MHCC-97H細(xì)胞系在5′-aza處理后RASSF1A的表達(dá)情況； B.在DNMT1敲低的SMMC-7721細(xì)胞系中分析RASSF1A的表達(dá)變化

Fig3InterferenceofDNAmethyltransferasesexpressionandactivitychangedtheexpressionlevelofRASSF1A

2.4 敲低DNMT1能夠誘導(dǎo)RASSF1A的表達(dá)

由于DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5′-aza主要作用于DNMT1，本研究在轉(zhuǎn)染DNMT1 siRNA及其對(duì)照載體的HCC細(xì)胞系SMMC-7721中，應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)了RASSF1A表達(dá)水平的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在DNMT1表達(dá)抑制的細(xì)胞系中，RASSF1A的表達(dá)水平升高(圖3B)。

2.5 DNMT1參與調(diào)控RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化狀態(tài)

運(yùn)用BGS及半巢氏PCR擴(kuò)增DNMT1抑制前后細(xì)胞中RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)，行克隆測(cè)序分析。利用DNA甲基化分析軟件BiQAnalyzer分析所克隆序列中CpG位點(diǎn)甲基化變化情況，所檢測(cè)區(qū)域中包含16個(gè)CpG位點(diǎn)(圖4)。16個(gè)CpG位點(diǎn)總的測(cè)序結(jié)果分析顯示，DNMT1的抑制沒(méi)有明顯改變RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)的甲基化程度(P>0.05)。RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)序列16個(gè)CpG位點(diǎn)經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)在線預(yù)測(cè)軟件TFSEARCH預(yù)測(cè)其轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合情況，發(fā)現(xiàn)第8、9個(gè)CpG位點(diǎn)和第14個(gè)CpG位點(diǎn)存在轉(zhuǎn)錄因子Sp1和USF結(jié)合的核苷酸序列(圖4)。這些CpG位點(diǎn)在DNMT1抑制的細(xì)胞系SMMC-7721-DNMT siRNA中呈半甲基化狀態(tài)，在其對(duì)照細(xì)胞系SMMC-7721-DNMT1對(duì)照組中呈完全甲基化狀態(tài)。

圖4BGS檢測(cè)SMMC-7721-DNMT1siRNA細(xì)胞系及其的對(duì)照細(xì)胞中RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化狀態(tài)變化

Fig4CpGsitesmethylationstatusoftheRASSF1ApromoterregionwasdetectedbyBGSinSMMC-7721celllinesthatknockdownDNMT1andthecontrolcells

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，在HCC細(xì)胞系中，RASSF1A的表達(dá)水平明顯低于正常肝細(xì)胞永生化細(xì)胞系及癌旁細(xì)胞系。該結(jié)果與前期文獻(xiàn)中所報(bào)道的RASSF1A在HCC細(xì)胞系中的表達(dá)變化情況[8]一致，提示RASSF1A失活在肝癌的發(fā)生中可能發(fā)揮一定作用。此外，我們的研究還發(fā)現(xiàn)，在表達(dá)HBx的HCC細(xì)胞系MHCC-97H、MHCC-97L及HepG 2.215中，RASSF1A表達(dá)水平降低，暗示了RASSF1A的表達(dá)可能受HBx的影響。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，正常肝細(xì)胞永生化細(xì)胞系L02、HCC癌旁細(xì)胞系QSG-7701和HCC細(xì)胞系SMMC-7721中轉(zhuǎn)染HBx基因使RASSF1A的表達(dá)水平也均有下降，提示HBx抑制了抑癌基因RASSF1A的表達(dá)，可能是HBx致HCC發(fā)生的分子機(jī)制之一。

在HCC中RASSF1A的啟動(dòng)子區(qū)DNA異常甲基化比率達(dá)到了80%以上[9]，啟動(dòng)子區(qū)DNA的異常甲基化被認(rèn)為是RASSF1A失活的主要機(jī)制?；诖?，本研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了HBx之后RASSF1A的表達(dá)水平均有所下降。以往研究顯示，HBx可以誘導(dǎo)DNMT1的表達(dá)[10]，提示HBx影響RASSF1A的表達(dá)可能與DNMT1有關(guān)。我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，抑制DNMT1后RASSF1A的表達(dá)水平有所回復(fù)，提示RASSF1A的表達(dá)受DNMT1的調(diào)控。隨后研究發(fā)現(xiàn)，DNMT1調(diào)節(jié)了RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)DNA的甲基化狀態(tài)，尤其改變了RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子Sp1和USF結(jié)合位點(diǎn)的甲基化程度。Sp1是屬于Sp/KLF家族的一類轉(zhuǎn)錄因子，由785個(gè)氨基酸構(gòu)成，分子質(zhì)量為100～110 kDa[11]；它可與DNA直接結(jié)合并增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄，其異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[12]。USF是一類HLH(Helix-Loop-Helix)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，可以通過(guò)二聚體的形式與DNA結(jié)合，增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄活性[13]。USF是一種在細(xì)胞質(zhì)中廣泛分布的轉(zhuǎn)錄因子，在黑色素瘤中USF表達(dá)增強(qiáng)[14]。而CpG位點(diǎn)的甲基化可抑制USF與DNA序列的結(jié)合，進(jìn)而使下游基因表達(dá)下調(diào)[15]。啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合位點(diǎn)的DNA甲基化有可能對(duì)以上兩種轉(zhuǎn)錄因子和DNA的結(jié)合產(chǎn)生抑制，從而導(dǎo)致RASSF1A表達(dá)的下調(diào)。

綜上所述，在肝細(xì)胞及HCC細(xì)胞系中，HBx可能通過(guò)上調(diào)DNMT1的表達(dá)，進(jìn)而改變RASSF1A的啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化狀態(tài)以調(diào)控其表達(dá)。DNMT1影響RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化程度主要集中在其啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子Sp1和USF結(jié)合位點(diǎn)，其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步探究。除此之外，HBx亦可能通過(guò)miRNA影響RASSF1A的表達(dá)[16]。盡管如此，DNMT1可能還存在其他途徑調(diào)節(jié)RASSF1A的表達(dá)，尚需進(jìn)一步的研究。

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