，， ，，

(河南省漯河市召陵區(qū)畜牧局，河南 漯河 462300)

動(dòng)物的腫瘤病治療和抗病選育一直是畜牧業(yè)發(fā)展需要解決的難題。 NK-lysin是一種具有抗微生物和腫瘤細(xì)胞的活性蛋白，是機(jī)體天然免疫的重要成分,具有極大的應(yīng)用價(jià)值[1]。研究表明，豬NK-lysin對(duì)大腸桿菌、巨大芽孢桿菌等多種病原微生物以及腫瘤細(xì)胞具有抗性[2-4]。

綿羊肺腺瘤病(OPA)是綿羊的一種慢性、進(jìn)行性、接觸性傳染的肺臟腫瘤性疾病[5-10],是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織確定的B類傳染病。該病以患羊咳嗽、呼吸困難、消瘦、大量漿液性鼻漏、II型肺泡上皮細(xì)胞和無纖毛細(xì)支氣管上皮細(xì)胞腫瘤性增生為主要特征[10]?！靶⊥栖囋囼?yàn)”是診斷 OPA的典型試驗(yàn)，即抬高病羊的前腿，病羊的鼻腔會(huì)有一些液體流出，這是OPA具有的典型臨床癥狀[11-14]。該病病原為外源性綿羊肺腺瘤病毒(JSRV),該病毒屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科[15]。NK-lysin基因主要與某些腫瘤細(xì)胞、病毒感染細(xì)胞、某些自身組織細(xì)胞(如血細(xì)胞)等相關(guān)，是機(jī)體抗腫瘤、抗感染的重要免疫因素，也參與第Ⅱ型超敏反應(yīng)和移植抗宿主反應(yīng)。近年來，新疆地區(qū)部分種羊場發(fā)生了綿羊肺腺瘤病,病羊可以通過咳嗽和喘氣將病毒排出, 經(jīng)呼吸道傳染給易感羊,造成羊群長期帶毒，難以凈化，給畜牧業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重的危害。資料表明,不同品種綿羊該病的易感性不同，其中美利奴綿羊的易感性最高[16]。本研究采集新疆兩個(gè)綿羊品種(哈薩克羊、薩?？搜?血液提取總RNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增綿羊NK-lysin基因全長CDS區(qū)段進(jìn)行測序，分析NK-Lysin在品種間和品種內(nèi)SNP的多態(tài)性,弄清新疆不同品種綿羊NK-lysin的多態(tài)性。另外,通過對(duì)建立的綿羊肺腺瘤病人工感染模型肺組織提取總RNA，經(jīng)熒光定量RT-PCR檢測發(fā)病和健康綿羊肺組織中NK-lysin基因的表達(dá)量，對(duì)比不同病理?xiàng)l件下綿羊NK-lysin基因的表達(dá)差異，對(duì)研究 NK-lysin基因突變與疾病的易感關(guān)系具有重大意義，為綿羊抗腫瘤分子機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物材料 采集人工感染綿羊肺腺瘤綿羊肺組織和正常綿羊肺組織，所有組織樣品均保存于-80℃。另外，采集哈薩克羊、薩福克羊血液樣本各50份，并迅速置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要儀器 生化培養(yǎng)箱(一恒科技公司，上海)；L1低溫連接儀(黑馬醫(yī)學(xué)儀器公司，中國)；PCR儀(D-370，德國)； DYY-6C型電泳儀(六一生物公司，北京)；Universal Hood II凝膠成像系統(tǒng)(Biorad公司，美國)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(羅氏公司，上海)

1.1.3 主要試劑 PCR試劑盒、DNA Marker購自TAKARA公司；Taq Master Mix、RNA提取試劑盒購自北京天根生物工程有限公司；其他常規(guī)試劑來自石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院病理實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

1.2.1 總DNA提取和樣品組織的總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 樣品的總DNA、RNA提取均參照使用TIANGEN公司的提取試劑盒說明書進(jìn)行。需反轉(zhuǎn)錄再進(jìn)行反轉(zhuǎn)cDNA，同樣參照說明書進(jìn)行(表1)。

表1 RT-PCR反應(yīng)體系

1.2.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank 登陸的NK-Lysin和ATPaseRV基因序列，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(表2)。由華大基因生物公司合成。

表2 NK-Lysin和ATPaseRV引物

1.2.3 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測 (1)PCR擴(kuò)增體系為25μl：2×buffer Mix 12μl；上、下游引物F/R各1μl；cDNA模板2μl；ddH2O 9μl；PCR反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性5min后，進(jìn)入95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃ 30s的循環(huán)，共循環(huán)35次；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

(2)PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在紫外燈下觀察是否擴(kuò)增出目的片段。

配制5TBE，用Tris54g,硼酸27.5g,0.5mol/L EDTA(PH=8)20mL,依次加入蒸餾水中，充分溶解，定容至1000mL,4℃保存。

將5TBE電泳緩沖液稀釋成1×TBE配制2%的瓊脂糖凝膠，以MarkerⅠ進(jìn)行分子量對(duì)照。1×TBE電泳緩沖液，150V，55mA電泳20min;打開凝膠成像儀的紫外燈拍照保存。

1.2.4 熒光定量RT-PCR 按照RT-PCRPromega公司qPCR Master試劑盒說明書進(jìn)行，具體操作如下(表3)：

表3 RT-PCR反應(yīng)體系

1.2.5 序列測定及分析 將檢測樣品送至上海生物技術(shù)公司進(jìn)行序列測定。測序結(jié)果應(yīng)用DNAMAN軟件進(jìn)行分析，分析綿羊NK-lysin基因SNP多態(tài)性，確定位點(diǎn)突變。利用生物信息學(xué)方法對(duì)NK-lysin基因SNP突變導(dǎo)致氨基酸序列改變后的蛋白構(gòu)象和功能進(jìn)行預(yù)測和分析，推測突變體和主要功能區(qū)段的結(jié)構(gòu)和功能并進(jìn)行篩選。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 以患病肺組織和正常肺組織獲得cDNA為模板，采用域值法(2-ΔΔCt)進(jìn)行相對(duì)定量[17]。該方法不需要繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，且較為方便和節(jié)省時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)由實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀測得各實(shí)驗(yàn)孔的Ct值，再分別算出同一cDNA樣本3個(gè)重復(fù)孔的Ct值的平均值，并以同一樣本的ATPaseCt值為內(nèi)參，按照公式2-ΔΔCt= 2- [( 實(shí)驗(yàn)組NK-Lysin Ct- 實(shí)驗(yàn)組ATPaseCt) -( 對(duì)照組NK-LysinCt- 對(duì)照組ATPase Ct) ]式中F即為NK-Lysin基因拷貝數(shù)[18]。計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組的2-ΔΔCt ，將對(duì)照的2-ΔΔCt設(shè)成1，然后將實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，進(jìn)行相對(duì)定量。

2 結(jié)果和分析

2.1 總DNA提取結(jié)果及RNA檢測濃度

本實(shí)驗(yàn)采集哈薩克羊、薩?？搜蜓簶颖咀鳛閷?shí)驗(yàn)材料提取總DNA，對(duì)所獲得的總DNA進(jìn)行濃度檢測。結(jié)果表明,獲得了質(zhì)量較好的總DNA，無污染，能夠滿足實(shí)驗(yàn)操作的要求(表4)。

表4 各樣品DNA檢測濃度

2.2 PCR檢測結(jié)果

(1)對(duì)樣本進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，電泳結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物符合預(yù)期目的片段的大小，可擴(kuò)增出與 441bp 預(yù)期值大小相符的核酸電泳帶(圖1)

圖1 PCR擴(kuò)增電泳圖M：DNA Marker 1：哈薩克羊NK-lysin基因 2：薩?？搜騈K-lysin基因

(2)對(duì)正常綿羊和感染綿羊的cDNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，所擴(kuò)增出的條帶與預(yù)期的目的片段長度相符，條帶清晰且無雜帶(圖2，圖3)。

圖2 NK-Lysin基因擴(kuò)增M：DNA Marker 1-3：為患病羊；4-6：為健康羊

圖3 ATPase基因擴(kuò)增M：DNA Marker 1-2：為患病羊；3為健康羊

2.3 軟件分析結(jié)果

測序所得核苷酸序列比對(duì)結(jié)果表明,薩?？搜蚝凸_克羊 NK-lysin基因存在多態(tài)性，存在突變。經(jīng)測序分析發(fā)現(xiàn)薩?？搜蛴?6 個(gè)點(diǎn)突變，而哈薩克羊只有 4 個(gè)突變，均為錯(cuò)義突變。錯(cuò)義突變分別是146堿基由 G變?yōu)?A和 171堿基由 A變?yōu)?G，也發(fā)現(xiàn)一個(gè)同義突變位點(diǎn)，分別是 74 堿基由 C 變 T(圖4)。

氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示,氨基酸序列中的32氨基酸由絲氨酸變?yōu)樘於０罚?5氨基酸由賴氨酸變?yōu)楦彼?圖5)。

圖4 哈薩克羊和薩?？搜蚝塑账岜葘?duì)結(jié)果

圖5 哈薩克羊和薩福克羊氨基酸比對(duì)結(jié)果

2.4 熒光定量

為了確定綿羊NK-lysin組織表達(dá)與疾病形成的關(guān)系，我們建立NK-Lysin熒光定量檢測方法(圖6)。

圖6 綿羊NK-lysin熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

擴(kuò)增曲線由Light Cycler 96 熒光定量PCR儀自動(dòng)生成(圖7，圖8)。本實(shí)驗(yàn)中，目標(biāo)基因和內(nèi)參基因的溶解曲線分析結(jié)果顯示，溶解曲線峰為單一峰形，未見其它峰值，并且峰的形狀也比較銳利。提示,各基因溶解溫度均一，擴(kuò)增產(chǎn)物特異性好，未見非特異性的雙鏈DNA產(chǎn)物或引物二聚體。

用2-ΔΔCt法分別對(duì)患病組三個(gè)樣本和對(duì)照組的Ct值進(jìn)行計(jì)算,結(jié)果(圖9)表明，患病組的表達(dá)量低于對(duì)照組。對(duì)肺腺瘤綿羊肺臟NK-lysin基因表達(dá)與健康綿羊?qū)Ρ?，其表達(dá)量明顯低于健康綿羊(圖10)，說明NK-lysin參與了肺腺瘤的病理形成，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

圖7 綿羊NK-LysinA和TPase cDNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增溶解曲線

圖8 NK-LysinA和TPase 的熔解曲線峰值圖

圖9 NK-Lysin cDNA拷貝數(shù)相對(duì)定量結(jié)果(注：1-3為患病組)

圖10 健康羊與肺腺瘤綿羊肺臟NK-lysin的表達(dá)

經(jīng)計(jì)算，1號(hào)患病綿羊的基因拷貝數(shù)為0.403，2號(hào)患病綿羊的基因拷貝數(shù)為0.117，3號(hào)患病綿羊的基因拷貝數(shù)為0.093。對(duì)照組正常綿羊的基因拷貝數(shù)為1，對(duì)照組/患病組的比值(表5)。

表5 對(duì)照組與患病組的比值

3 討論

資料表明，NK-Lysin在動(dòng)物不同品種的多態(tài)性使其結(jié)構(gòu)和功能上存在差異，并且與多種感染性疾病病理過程密切相關(guān)。人的NK-Lysin能夠殺死胞內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌，與結(jié)核病的病理形成有關(guān)[19]。Mi Ok Leea等對(duì)白色來航雞和考尼什雞的NK-lysin基因的多態(tài)性研究表明，NK-lysin基因在271位的A-G的突變導(dǎo)致一個(gè)氨基酸由 Asn (N)突變?yōu)?Asp (D)，這種SNP突變導(dǎo)致其合成多肽的殺菌和抗腫瘤能力存在明顯差異，NK-lysin基因的遺傳多樣性研究為抗腫瘤選育提供了新思路[20]。

Kandasamy等的研究結(jié)果顯示，水牛NK-Lysin基因的表達(dá)量在脾臟、淋巴結(jié)較高，在子宮內(nèi)膜中等，在肝臟、腎臟較低[21]。張殿卿等[19]研究結(jié)果顯示,綿羊NK-Lysin基因在肩前淋巴結(jié)、脾臟及血液中有不同程度的表達(dá)，其在脾臟中的表達(dá)量最高，并顯著影響免疫反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)熒光定量PCR檢測患綿羊肺腺瘤病綿羊和正常綿羊的肺組織中NK-Lysin基因的表達(dá)量，結(jié)果表明,NK-Lysin基因在發(fā)病綿羊肺組織中的表達(dá)量低于健康綿羊肺組織中的表達(dá)量。

本實(shí)驗(yàn)采用的實(shí)時(shí)熒光定量PCR可以免受酶活性、擴(kuò)增效率、尤其是平臺(tái)效應(yīng)等諸多因素的影響，因此檢測結(jié)果更加精確。另外此方法還避免了待檢樣本的污染，防止假陽性結(jié)果上升，可以做到實(shí)時(shí)觀測。綜上所述，這個(gè)方法是最適合檢測不同狀態(tài)下肺組織中NK-Lysin基因的表達(dá)水平。

4 結(jié)論

(1)新疆哈薩克羊和薩?？搜騈K-lysin基因存在多態(tài)性，這些突變可能改變NK-lysin基因的功能，對(duì)研究 NK-lysin基因突變與疾病的易感關(guān)系具有重要意義。

(2)通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)患病組和對(duì)照組肺組織的NK-Lysin基因進(jìn)行相對(duì)定量，NK-Lysin基因在健康綿羊肺組織中的表達(dá)量高于發(fā)病綿羊肺組織中的表達(dá)量，說明患綿羊肺腺瘤的綿羊的NK細(xì)胞和細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞(CTL)抑制了NK-Lysin基因的表達(dá)，推測NK-Lysin基因可能參與了機(jī)體抗病毒的防御機(jī)制。

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