曹華平，葉 濤，李永忠，喻 璐,閔 華

燒傷或高能量損傷所致的大面積皮膚軟組織缺損傷口的修復一直是臨床上較為棘手的難題，全球每年在此類患者的診治工作上耗費了大量的人力物力，但臨床療效遠不能令人滿意[1]。

血管內皮細胞、周細胞及血管平滑肌細胞在復雜性創(chuàng)面的修復與愈合中扮演著重要角色，也是傷口肉芽組織再生及成熟的必須組織細胞來源[2-3]。由此，如何在體外大量擴增或在創(chuàng)面局部刺激誘導再生上述細胞，是臨床上應用組織工程修復治療難愈性創(chuàng)面的關鍵。

干細胞治療，特別是利用骨髓來源的間充質干細胞(BMSCs)強大的定向分化能力，已經(jīng)被證實可參與皮膚傷口的修復，尤其在上皮細胞再生以及血管重建過程中扮演著重要角色[4-5]。但遺憾的是，一直以來，外源性的BMSCs在移植至受體后較低的存活率以及移植成功率極大地阻礙了其在臨床上的應用。有學者分析這可能與創(chuàng)面愈合過程中Wnt/β-catenin信號通路功能低下有關[6]。

Wnt 蛋白負責調節(jié)細胞增殖、分化、活力、極性等一系列的生物學行為[7]。新近研究表明 Wnt 蛋白及其下游信號通路在間充質干細胞的增殖及分化過程中發(fā)揮重要作用[8]。但目前為止關于經(jīng)典 Wnt 信號通路對于干細胞，尤其是誘導BMSCs向皮膚傷口重建所需細胞的定向分化中的調節(jié)作用尚無定論。因此，本實驗中將BMSCs作為種子細胞移植于皮膚軟組織缺損動物傷口，并通過分子生物學方法觀察經(jīng)典Wnt蛋白(Wnt3a)對BMSCs的定向分化是否具有正向誘導作用，以及BMSCs與Wnt3a聯(lián)合應用后對創(chuàng)面修復是否具有促進作用，從而為臨床上難愈性創(chuàng)面修復的治療提供新的思路。

材料與方法

1 實驗材料與儀器

清潔級SD大鼠80只，雄性，3周齡，體重40～50g，購自武漢大學-實驗動物中心。OLYMPUS 倒置顯微鏡(IX-51)(OLYMPUS公司,日本)，超凈工作臺 (中國蘇州安泰空氣技術有限公司，解剖器械：組織剪，血管鉗，組織鑷，顯微器械，手術刀(片)(上海醫(yī)療器械集團有限公司，中國)，二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱 (Forma公司，美國)，熒光定量PCR儀(StepOneTM Real-Time PCR System)。Wnt3a蛋白(R&D公司)。兔抗大鼠抗體CD31，a-SMA，VEGF,NG2(Abcam,美國)。大鼠TGF-β試劑盒Rat LAP(TGF beta 1)Ready-SET-Go(eBiocsience，美國)。

2 實驗方法

2.1大鼠骨髓間充質干細胞(BMSC)提取、分離、培養(yǎng)及鑒定 過量乙醚處死大鼠，以75%乙醇浸泡5min消毒。用無菌手術器械在盡量保持大鼠雙股骨和脛骨的完整性的條件下剔除皮膚、皮下組織、脂肪、肌腱、韌帶、神經(jīng)及血管。用組織剪分別剪去長骨兩端骨骺，暴露骨髓腔，以20mL注射器吸取含低糖DMEM培養(yǎng)液(含15%血清，1%雙抗)反復沖洗骨髓腔，待骨髓收集完全，骨組織沖至發(fā)白后，將收集到的骨髓細胞及組織懸液離心(1 200r/min，7min)，棄上清，加入完全培養(yǎng)基，重懸細胞。接種于25cm2培養(yǎng)瓶，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并標記為原代。待細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底(約90%密度)時以0.25%胰蛋白酶消化細胞后傳代培養(yǎng)。選擇第三代用于后續(xù)實驗。

2.2BMSC細胞分組及處理

將BMSC分為對照組及Wnt3a組,6孔板培養(yǎng)，每組3個復孔。對照組以DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，Wnt3a組以DMEM+Wnt3a信號通路激動劑Wnt3a(終濃度為200μg/L)培養(yǎng)。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，每隔3d換液1次，共培養(yǎng)7～10d。

2.3動物模型制作、分組及相關處理 動物按照隨機數(shù)字法分為4組(每組20只)。實驗第1天，所有動物施行麻醉(腹腔注射60mg/kg鹽酸氯胺酮)。手術過程由同一位具有豐富外科手術經(jīng)驗的醫(yī)師施行(單盲)。大鼠取俯臥位，背部脫毛，碘伏消毒，鋪單。以后正中線為縱徑，行橢圓形全層皮膚切口(直徑2cm)，切除皮膚，皮下組織直至腰背筋膜。BMSCs注射組：約3× 106個BMSCs以100μL PBS重懸成單細胞懸液，經(jīng)1mL注射器在皮膚傷口周緣等分以后分12點皮下注射；Wnt3a組：約500μL 含Wnt3a的PBS溶液(200μg/L)，經(jīng)1mL注射器在皮膚傷口周緣等分以后分12點皮下注射；BMSCs+Wnt3a組: 先行Wnt3a注射，再行BMSC注射，注射部位及注射量同前述分組；假手術組：除全層皮膚切口以外，不做其余處理。四組大鼠手術完畢后均以生物半透膜(VSD醫(yī)療技術公司，武漢)覆蓋以封閉傷口，避免水凝膠外漏及傷口干燥。健康SD大鼠作為空白對照。所有大鼠均單籠飼養(yǎng)。

于術后第3、7、11和16天，取傷口處組織活檢行后續(xù)實驗。為后續(xù)組織學病理檢測，所得活檢組織立即經(jīng)OCT包埋劑包埋，-80°C保存，供后續(xù)RT-PCR檢測用，或經(jīng)4%多聚甲醛固定過夜然后由石蠟包埋行HE染色，Masson’s Trichrome 染色，免疫熒光染色等。所有病理檢測均由兩位病理醫(yī)師操作及讀片(單盲)。

2001年，按照國家計委、交通部的統(tǒng)一部署，做為主要技術業(yè)務骨干，王世君參與完成了全縣地方道路的公路網(wǎng)絡規(guī)劃工作。2010年在雞東縣交通運輸局作為主要技術骨干之一參與完成雞東縣交通局“十二五規(guī)劃”工作，為該縣的農(nóng)村公路建設打好了基礎。

2.4免疫熒光染色觀察相關標志物表達 BMSCs(對照組及Wnt3a組)免疫熒光染色法觀察相關標志物(Oct4,Klf4，NG2，CD31，VEGF,a-SMA)的表達。去掉培養(yǎng)皿或孔板中的培養(yǎng)基，加入4%多聚甲醛室溫固定細胞20min。PBS漂洗3次，加破膜工作液孵育10min，加入3%過氧化氫溶液，室溫避光孵育10min。甩干后5%BSA封閉20min，加入約50μL稀釋的一抗[兔抗大鼠VEGF(1:200),CD31(1:100)，NG2(1：50)，a-SMA(1:100),Oct4(1:100),Klf4(1:100)]覆蓋玻片，4℃過夜。加50μL二抗[Cy3-AffiniPure F(ab’)2 Fragment Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)，1:50]，4℃孵育50min。加DAPI染液，避光孵育5min。滴加抗熒光淬滅封片劑，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.5Real-Time PCR 取各組處理后的BMSCs，去除板中培養(yǎng)液，加1m LPBS溶液(4℃)，小心洗滌；對于組織中相關指標的檢測，將各組大鼠在各時間點行傷口組織取活檢后用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit(Takara Bio,Japan)提取RNA。使用EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix進行cDNA合成。取12.5μL的2× qPCR Mix，2.0μL的2.5μM內標引物，2.0μL的cDNA，8.5μL的雙蒸水,按以下程序進行PCR擴增：預變性(1min，95℃)，緊接著為40個循環(huán)擴增(分別為95℃下15s，58℃下20s，72℃下20s)，最后再以72℃持續(xù)5min后以每20s升溫1℃的速度進行溶解。以2-△△Ct法計算結果。RT-PCR所用引物序列見表1。

3 統(tǒng)計學分析

結 果

1 大鼠骨髓間充質干細胞(BMSCs)的體外分離、純化、培養(yǎng)及鑒定

所分離的細胞72h后在光鏡下觀察時可見呈紡錘狀或梭形，偽足明顯(見圖1a)。繼續(xù)換液觀察，見紡錘狀細胞逐漸形成集落，呈簇狀生長。10d后類似于成纖維細胞，細胞間隙變小，形成漩渦狀(見圖1b)。免疫熒光染色顯示，在所提取細胞核內，Oct4及Klf4呈強陽性表達，提示所提取細胞具有干細胞多能分化的特性(圖1c)。

表1 RT-PCR所用引物序列

注：引物由Invitrogen Biotechnology Co.,LTD中國公司合成

2 Wnt3a誘導 BMSCs的定向分化

RT-PCR的結果顯示，Wnt3a組在加入Wnt3a激動劑培養(yǎng)7d以后，BMSCs的干細胞相關分子Klf4，Oct4表達水平相比對照組有相應下降(0.732±0.048，0.591±0.097，倍比數(shù)，P<0.001)(圖2a)，證實BMSCs發(fā)生了相應的分化行為，一定比例的干細胞分化成為體細胞。進一步研究發(fā)現(xiàn)，代表周細胞、血管內皮細胞及血管平滑肌細胞的標志物-NG2、VEGF、CD31及α-SMA在Wnt3a作用下mRNA表達水平明顯增高(圖2b)。免疫熒光染色的結果與RT-PCR一致(圖2c)。

3 Wnt3a聯(lián)合BMSCs移植修復皮膚創(chuàng)面的動物創(chuàng)面大體觀察和組織病理學檢測

運用單因素方差分析統(tǒng)計，筆者發(fā)現(xiàn)術后第16天，BMSCs+Wnt3a組大鼠傷口創(chuàng)面愈合率為(87.05±1.93)%，遠優(yōu)于假手術組(48.88±3.62)%，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.001)(圖3a，圖4g)。

為觀察BMSCs/+Wnt3a移植后對皮膚傷口修復過程中創(chuàng)面肉芽組織再生和膠原沉積情況，筆者運用組織病理學方法(HE染色,Masson三色染色法)觀察傷口情況。結果顯示，在第16天，BMSC+Wnt3a移植大鼠傷口創(chuàng)面顯示出生長良好的肉芽組織，以豐富的血管組織及周圍的膠原纖維為標志，且膠原排列整齊，疊加有序。與之相比，假手術組中則僅能觀察到少數(shù)肉芽組織和疏松的結締組織(圖3c)。

慢性傷口由于多種原因造成的病理過程可產(chǎn)生過度的炎性環(huán)境，尤其是中性粒細胞/及高含量的基質金屬蛋白酶的存在，引起傷口修復過程中產(chǎn)生的新生膠原蛋白分解，而PDGF(血小板源性生長因子)的存在能夠緩解及抑制上述病理過程的發(fā)生發(fā)展，從而促進創(chuàng)面愈合[9]。因此，筆者對創(chuàng)面促血管化因子PDGF的mRNA表達進行了檢測，結果表明BMSCs/Wnt3a組大鼠創(chuàng)面PDGF的基因表達水平明顯高于其余3組(P<0.001，圖4a)。本研究運用分子生物學的方法觀察術后第7及第11天，各組大鼠傷口創(chuàng)面血管化相關指標(NG2，CD31，VEGF,α-SMA)的mRNA水平。與前述結果類似，BMSCs/Wnt3a聯(lián)合治療后大鼠在各時間點的上述指標表達水平均明顯高于假手術組(P<0.001)( 圖4b～e)。除此之外，作為創(chuàng)面血管化的始動因子，BMSCs/Wnt3a聯(lián)合治療后大鼠創(chuàng)面TGF-β1的含量在各時間點均高于其余3組(P<0.001)(圖4f)。

討 論

目前已有諸多研究結果證實骨髓間充質干細胞(BMSCs)在皮膚創(chuàng)面的血管化再生中扮演著重要角色[4]。理想狀態(tài)下，當皮膚傷口形成后，機體將動員自身MSCs進入血液循環(huán)，歸巢于皮膚傷口創(chuàng)面，并分化為創(chuàng)面修復所需的目標細胞[10]。但臨床上能夠真正遷徙至創(chuàng)面的內源性MSCs實際上十分有限。因此，許多學者開始研究將外源性干細胞，或者將自體骨髓干細胞提取后體外擴增再回植于創(chuàng)面，并取得一定效果[11]。本實驗即采用經(jīng)典且簡單有效的全骨髓貼壁法分離BMSCs,可見BMSCs成簇狀集團式貼壁生長,隨著時間推移細胞胞體逐漸兩極化，呈梭形生長,為BMSCs早期典型形態(tài)。這表明全骨髓貼壁分離法對BMSCs的生長狀態(tài)影響較小,與既往已有報道吻合[12]。此外，骨髓間充質干細胞具有干細胞的多能分化特性，可定向分化為一些組織和器官細胞，其細胞核高表達干細胞相關標志物(Oct4,Klf4,Nanog等)[13]。本實驗運用免疫熒光染色技術對所提取的細胞爬片后進行染色，結果表明細胞核內高表干細胞多能性相關標志物Oct4及Klf4,進一步證實所提取細胞為骨髓來源的間充質干細胞。

圖1 骨髓間充質干細胞的形態(tài)學觀察及鑒定結果。a.72h后BMSCs貼壁生長情況(×100);b.10d后BMSCs貼壁生長情況(×100);c.免疫熒光染色證實所提取細胞細胞核內高表達干細胞多能性相關標記物Oct4及Klf4(×100)

**P<0.01,***P<0.001

圖2 Wnt3a誘導BMSCs定向分化的體外實驗。a.RT-PCR結果顯示W(wǎng)nt3a誘導后BMSCs的多能干細胞相關標記物Oct4以及Klf4的mRNA水平較對照組(普通培養(yǎng))有明顯下降(P<0.001)；b、c.分別顯示運用RT-PCR以及免疫熒光染色觀察三維培養(yǎng)下BMSCs的定向分化情況以及相關特異性標記物的mRNA水平及蛋白表達情況(×100)

BMSC+Wnt3a組大鼠與假手術組相比:**P<0.01,***P<0.001

圖3 各組大鼠術后創(chuàng)面修復病理學觀察。a.傷口愈合曲線證實BMSC+Wnt3a聯(lián)合應用組大鼠傷口愈合優(yōu)于其余三組;b.各組大鼠肉芽組織形成及創(chuàng)面成熟度評分;c.HE染色、Masson三色染色顯示術后第11天各組大鼠創(chuàng)面肉芽組織形成及血管再生情況(×100)

**P<0.01,***P<0.001。標尺=0.8cm

圖4 各組大鼠術后創(chuàng)面血管化再生指標觀察。a～e.RT-PCR觀察各組大鼠術后第7、11天PDGF、NG2、α-SMA、CD31以及VEGF的mRNA水平;f.ELISA法檢測創(chuàng)面第3、7、11天TGF-β含量對比;g.各組大鼠在手術當日及手術后第16天皮膚傷口的大體照片

臨床上，僅僅提高BMSCs在創(chuàng)面的移植率是不夠的，遠不足以發(fā)揮其特有的再生修復特性。創(chuàng)面修復中，創(chuàng)面血管化是關鍵的步驟。其包括血管芽生和初始血管的重排，由此引起壁細胞的定植和活化(在小血管中為周細胞，大血管中為血管平滑肌細胞)[14]。另一方面，血管內皮細胞和壁細胞之間的相互作用也對微血管的穩(wěn)定至關重要，從而進一步影響傷口后期血管的成熟[14]。由此可見，周細胞、血管內皮細胞以及血管平滑肌細胞在創(chuàng)面血管化中扮演了重要作用。故BMSCs在移植后如何定向分化為上述關鍵細胞，將是BMSCs在皮膚傷口修復應用中的關鍵所在。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，Wnt信號通路對干細胞分化、細胞增殖及生長有重要的調節(jié)作用[15]。經(jīng)典Wnt 通路信號因子包括Wnt1、Wnt3a 和Wnt8a等，可通過調控β連環(huán)蛋白(β-catenin)的水平發(fā)揮其生理作用，最終激活β-Catenin進入細胞核內激活下游相關靶基因的轉錄[16]。有報道證實，Wnt3a蛋白能夠促進骨髓間充質干細胞的增殖，但會抑制其向軟骨細胞的分化[17]；另有研究指出，小劑量(10μg/L)Wnt3a能在bFGF存在的情況下誘導MSC向神經(jīng)元細胞方向分化[18]。在體外實驗中，筆者運用大劑量Wnt3a蛋白(200μg/L)加入培養(yǎng)基，在7d誘導培養(yǎng)之后發(fā)現(xiàn)，代表周細胞、血管內皮細胞及血管平滑肌細胞的標志物——NG2、VEGF、CD31及α-SMA的mRNA表達水平明顯增高，免疫熒光染色顯示上述標志物在細胞質內高表達，證實BMSC發(fā)生了相應的定向分化。筆者分析，這與大劑量Wnt3a蛋白激活了經(jīng)典Wnt信號途徑，并誘導β-Catenin進入細胞核內，從而激活相關下游靶基因的轉錄有關，這與Fan等[19]的研究結果一致，即經(jīng)典的Wnt信號通路能夠與非經(jīng)典的Wnt信號通路相互作用，最終實現(xiàn)干細胞向體細胞的定向分化。

隨后，筆者在大鼠全層皮膚缺損的動物模型上聯(lián)合應用BMSCs與Wnt3a蛋白，結果發(fā)現(xiàn)代表兩者聯(lián)合應用能夠顯著縮短創(chuàng)面愈合時間，促進傷口肉芽組織的再生與成熟。不僅如此，筆者首次發(fā)現(xiàn)BMSC與Wnt3a聯(lián)合應用組大鼠創(chuàng)面新生血管的生成速度明顯高于對照組，且創(chuàng)面PDGF及TGF-β的mRNA水平明顯升高，這反映了創(chuàng)面血管的成熟化加速，由此大大促進了肉芽組織再生及傷口重建。這一發(fā)現(xiàn)對臨床上復雜性及難愈性創(chuàng)面的干細胞治療具有重要意義。

綜上所述，筆者的實驗結果發(fā)現(xiàn)，大鼠骨髓間充質干細胞在大劑量Wnt信號通路激動劑(Wnt3a蛋白)的誘導下，具有定向分化為皮膚創(chuàng)面修復所需關鍵細胞的作用，在此過程中，經(jīng)典的Wnt信號通路被激活，與非經(jīng)典的Wnt信號通路相互作用，最終實現(xiàn)干細胞向體細胞的定向分化。本實驗結果不僅有助于提高臨床上外源性間充質干細胞移植修復創(chuàng)面的存活率，還可為干細胞定向分化促進創(chuàng)面愈合與修復提供新的治療思路。相對于傳統(tǒng)紗布包扎及換藥而言，此聯(lián)合療法具有省時，簡單易行，有效的優(yōu)點，具有十分重要的臨床意義。

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