◎ 劉雅頎，尹曉清，喻志林，郭曉雙

（1.湖北瑞邦生物科技有限公司，湖北 荊州 434000；2.北京百生康健康產(chǎn)業(yè)有限公司，北京 100020）

鱷魚有“活化石”之稱，具有壽命最長(zhǎng)、免疫力最強(qiáng)、終身不患癌癥、骨頭最硬的特征。鱷魚的醫(yī)藥價(jià)值遠(yuǎn)在犀角、虎骨之上，在醫(yī)學(xué)上享有“動(dòng)物黃金”之美譽(yù)，因此國(guó)內(nèi)外對(duì)其研究日益加深[1-2]。目前。已有許多學(xué)者利用生物酶解技術(shù)以沙丁魚、油菜籽、鰱魚等多種原料制備了許多抗氧化活性多肽[3-5]。據(jù)研究報(bào)道，鱷魚肉中含人體8種必需氨基酸，是優(yōu)勢(shì)的蛋白資源[6]。除此之外，抗氧化肽是目前國(guó)內(nèi)外研究較多的一種生物活性肽，安全、穩(wěn)定、高效[7-8]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)鱷魚的研究主要側(cè)重于養(yǎng)殖方面，在對(duì)鱷魚肉多肽抗氧化性研究方面還沒有系統(tǒng)性的報(bào)道。Zhong[9]只是研究報(bào)道相對(duì)分子質(zhì)量＜1 000組分的自由基清除能力較強(qiáng)。

本研究采用0.8%堿性蛋白酶對(duì)鱷魚肉進(jìn)行酶解，通過減少相對(duì)分子質(zhì)量的大小，進(jìn)行抗氧化活性研究，探討鱷魚肽的生物活性變化，為功能性鱷魚肉蛋白產(chǎn)物的開發(fā)利用提供一定理論基礎(chǔ)和應(yīng)用基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

鱷魚肉由北京百生康提供，于-18 ℃冷凍保存；1,1-二苯基-2-苦基腙肼（DPPH），購(gòu)于Sigma公司，分析級(jí)；硫酸亞鐵、三氯乙酸、無水乙醇、濃硝酸、磷酸緩沖液、雙氧水、鄰非羅啉、三氯化鐵，購(gòu)于中國(guó)國(guó)藥，分析級(jí)；甲醇、乙腈、氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于中國(guó)國(guó)藥，色譜級(jí)；堿性蛋白酶 購(gòu)于諾維信，食品級(jí)。

高效液相色譜儀LC-20AT，C18column （250 mm×4.6 mm），日本島津；紫外分光光度儀mini-1240（Shimadzu公司）；生化培養(yǎng)箱SPX-250B-Z（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1鱷魚肉漿液制備

將鱷魚肉洗凈后，準(zhǔn)確稱重，切小塊加入2倍水，放入均質(zhì)機(jī)中勻漿。

1.2.2鱷魚多肽液制備

向鱷魚肉漿液中加入鱷魚肉質(zhì)量0.8%的堿性蛋白酶，持續(xù)酶解6 h。酶解條件為60 ℃、pH 9.0（加NaHCO3調(diào)節(jié)pH）。每隔0.5 h取樣，高溫滅酶，過濾，得到不同酶解時(shí)間（0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 h和4.5 h）的酶解鱷魚多肽液。

1.2.3鱷魚脫色多肽液制備

將鱷魚多肽液準(zhǔn)確量取體積V，加入鱷魚多肽液質(zhì)量2%的活性炭，在50 ℃條件下脫色2 h。

1.2.4相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定

酶解物相對(duì)分子質(zhì)量分布的測(cè)定采用凝膠層析法[10-11]，由Sephadex G-15柱(φ1.1 cm×50 cm)分析檢測(cè)。

1.2.5抗氧化性測(cè)定

1.2.5.1DPPH自由基清除能力測(cè)定

利用DPPH醇溶液呈紫色并在517 nm處有強(qiáng)吸收的特點(diǎn)定量測(cè)定鱷魚多肽制備過程中，DPPH清除能力的變化。將1 mg的DPPH溶于無水乙醇，定容至10 mL，配制成0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液，避光保存。取1 mL固形物含量為2%的樣品溶液（鱷魚肉漿、鱷魚酶解液和鱷魚脫色液）和4 mL的DPPH醇溶液于棕色帶塞試管中，均勻震蕩，在室溫下避光反應(yīng)30 min后立即在517 nm處測(cè)定其吸光值A(chǔ)s。再取1 mL固形物含量為2%樣品溶液和4 mL無水乙醇溶液，均勻混合在相同條件下反應(yīng)，測(cè)定吸光值A(chǔ)0。取1 mL蒸餾水和4 mL的DPPH醇溶液均勻混合在相同條件下反應(yīng)，測(cè)定吸光值A(chǔ)c。按照公式（1）計(jì)算鱷魚酶解不同時(shí)間條件下的抗氧化性變化。

式（1）中，A0為空白組吸光值；Ac為對(duì)照組吸光值；As為樣品測(cè)定值。

1.2.5.2羥基自由基（OH）清除能力測(cè)定

利用Fenton反應(yīng)將1.0 mL的7.5 mmol/L鄰菲羅啉與2.0 mL pH 7.4的磷酸鹽緩沖液，1.0 mL 7.5 mmol/L硫酸亞鐵溶液充分混勻。再加入0.1% H2O2溶液，加入1 mL的質(zhì)量濃度2%的樣品溶液震蕩均勻后置于37 ℃水浴中反應(yīng)60 min，在536 nm處測(cè)定其吸光度As。再用1 mL的蒸餾水代替樣品做空白對(duì)照A0。用1 mL蒸餾水代替H2O2，1 mL蒸餾水代替樣品，測(cè)定吸光值A(chǔ)c。

式（2）中，A0為空白組吸光值；Ac為對(duì)照組吸光值；As為樣品測(cè)定值。

1.2.5.3超氧陰離子自由基清除能力測(cè)定

反應(yīng)顯色體系：4.5 mL pH為8.34的磷酸緩沖液，1.2 mL蒸餾水在25 ℃下保溫30 min，加入0.3 mL 25℃的鄰苯三酚，4 min后立即在325 nm下測(cè)定吸光值A(chǔ)z。另將0.5 mL樣品、0.7 mL蒸餾水、4.5 mL的磷酸緩沖液在25 ℃下保溫30 min，加入0.3 mL 25 ℃的鄰苯三酚，在4 min后立即在325 nm下測(cè)定吸光值A(chǔ)s。

式（3）中，Az為4 min內(nèi)鄰苯三酚的自氧化吸光值；As樣品氧化后吸光值。

2　結(jié)果與討論

2.1　DPPH自由基清除能力

經(jīng)測(cè)定，鱷魚肉漿清除自由基DPPH能力為48.68%，低于部分鱷魚肽。如圖1所示，不同酶解程度的鱷魚肽相對(duì)分子質(zhì)量不同，氨基酸的組成不同清除自由基DPPH能力不同。隨著酶解程度的不斷加深，鱷魚蛋白不斷被水解成多肽、氨基酸疏水基不斷暴露，相對(duì)分子質(zhì)量變小。

圖1　鱷魚肉酶解時(shí)間對(duì)多肽液DPPH自由基清除能力和相對(duì)分子質(zhì)量的影響圖

在堿性蛋白酶酶解2 h時(shí)，鱷魚肽分子量為2 200時(shí)，鱷魚肽清除自由基DPPH的能力最強(qiáng)，達(dá)到85.4%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于鱷魚肉漿清除自由基能力46.68%。說明酶解蛋白成小分子肽有利于對(duì)自由基DPPH清除能力的提高，有助于鱷魚功效性提升。但繼續(xù)酶解鱷魚蛋白，鱷魚蛋白繼續(xù)水解成更小分子，其清除自由基DPPH能力降低。這一趨勢(shì)說明鱷魚肽在一定分子量范圍內(nèi)，多肽鏈具有較強(qiáng)的清除自由基DPPH能力。

2.2　羥基自由基（OH）清除能力

如圖2所示，酶解時(shí)間越長(zhǎng)，鱷魚肉多肽液中的相對(duì)分子質(zhì)量逐漸減小，其羥基自由基清除能力逐漸增加到平穩(wěn)趨勢(shì)，考慮到鱷魚肉多肽液的活性，發(fā)現(xiàn)酶解時(shí)間在2 h時(shí)，在相對(duì)分子質(zhì)量為2 200時(shí)，羥基自由基的清除能力高達(dá)83.479%，與其DPPH自由基清除能力相呼應(yīng)，說明相對(duì)分子質(zhì)量過低，酶解時(shí)間過長(zhǎng)，其鱷魚肉多肽液的生物活性反而不是最高。

圖2　鱷魚肉酶解時(shí)間對(duì)多肽液羥基自由基清除能力和相對(duì)分子質(zhì)量的影響圖

2.3　超氧陰離子自由基清除能力

如圖3所示，酶解時(shí)間越長(zhǎng)，鱷魚肉多肽液相對(duì)分子質(zhì)量逐漸減小，其超氧陰離子自由基清除能力逐漸增加，考慮到鱷魚肉多肽液的活性，發(fā)現(xiàn)酶解時(shí)間在2 h時(shí)，在相對(duì)分子質(zhì)量為2 200時(shí)，超氧陰離子自由基的清除能力高達(dá)75.976%，但是都低于DPPH和OH自由基的清除能力，高于其他魚肉自由基清除能力，與其DPPH自由基、羥基自由基清除能力相呼應(yīng)，說明相對(duì)分子質(zhì)量過低，酶解時(shí)間過長(zhǎng)，其鱷魚肉多肽液的生物活性反而不是最高。

圖3　鱷魚肉酶解時(shí)間對(duì)多肽液超氧陰離子自由基清除能力和相對(duì)分子質(zhì)量的影響圖

3　結(jié)論

經(jīng)過堿性蛋白酶酶解后的鱷魚肉多肽液對(duì)DPPH、OH和超氧陰離子自由基的清除能力不同，且酶解時(shí)間對(duì)其影響也是不同程度的變化的，而酶解時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致相對(duì)分子質(zhì)量的大大減小，導(dǎo)致多肽含量過高，生物活性降低明顯。當(dāng)酶解時(shí)間為2 h時(shí)，相對(duì)分子質(zhì)量為2 200時(shí)，鱷魚肉多肽液對(duì)DPPH、OH和超氧陰離子自由基的清除能力分別是85.4%、83.479%、75.976%，表現(xiàn)出較好的抗氧化性，具備作為天然抗氧化劑的潛力。