李思佳 張鶴

（1，北京市第一七一中學(xué) 100013；2，中國科學(xué)院微生物研究所 100080）

2013年3月，黃浦江松江段水域發(fā)生漂浮死豬事件，上海市動物疫病預(yù)防控制中心現(xiàn)場采集了死豬內(nèi)臟樣品進行檢測，從一份樣品中檢出豬圓環(huán)病毒。我國自從2000年郎洪武首次報道檢測出PCV2抗原以來，浙江、北京、四川、黑龍江等省也報道有PCV2的感染[1]。

豬圓環(huán)病毒 （Porcine Circovirus，PCV）是迄今發(fā)現(xiàn)的最小的動物病毒之一?，F(xiàn)已知PCV有兩個血清型，豬圓環(huán)病毒I型 (PCV1)和Ⅱ型 (PCV2)。PCV1為非致病性病毒，PCV2為致病性病毒，本實驗對象為PCV2。PCV2與豬群中發(fā)生的多種疾病相關(guān)，其可引起奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征 (PMWS)、豬皮炎與腎病綜合征 (PDNS)、豬呼吸道疾病綜合征 (RDC)、豬先天性振顫等疾病[1]。目前，豬圓環(huán)病毒病及其相關(guān)性疾病在我國豬病中所占的主導(dǎo)地位愈發(fā)明顯。因PCV2具有免疫抑制特性，從而使感染豬不能對其他疫苗或病原體產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答，對其他疾病的易感性增強，易誘發(fā)混合感染，導(dǎo)致癥狀更為復(fù)雜。為減少豬圓環(huán)病毒Ⅱ型 （PCV2）的發(fā)生，降低養(yǎng)殖戶經(jīng)濟損失，對PCV2的研究尤為重要。

1 材料

實驗材料：細胞培養(yǎng)液 (90%DMEM+10%胎牛血清+0.1%抗生素)、無血清培養(yǎng)液 （100%DMEM）、PBS緩沖液(1LH2O： 8gNaC1+0.2gKC1+3.58gNa2HPO4·12H2O+0.24gKH2PO4)、病豬的肺臟組織、胰酶、DNA提取盒、5%CO2培養(yǎng)箱、電泳儀，PCR擴增儀

2 PCV2病毒

PCV2病毒是國際病毒分類委員會 (ICTV)第六次分類學(xué)術(shù)報告新增的圓環(huán)病毒科 (Circoviridae)，圓環(huán)病毒屬 (Circovirus)的成員，PCV2是圓環(huán)病毒屬的代表種，是目前發(fā)現(xiàn)的最小的脊椎動物病毒[1]。PCV是己知的能在哺乳動物細胞中進行自我復(fù)制的最小病毒，是一種無囊膜、單鏈環(huán)狀DNA病毒[2]。

3 PK-15細胞

3.1 PK-15細胞

PK-15細胞為豬腎上皮細胞，來源于豬腎，該細胞對多種病毒比較敏感，如PCV、豬細小病毒 （PPV）、豬瘟病毒（CSFV） 等。

PK-15細胞系是體外培養(yǎng)PCV2的良好宿主細胞，把PCV2接種到?jīng)]有污染的單層PK-15細胞上可以獲得良好的病毒增殖[1]。病毒在細胞中的復(fù)制需依賴細胞生長周期S期的細胞表達蛋白，同時組織細胞的增殖為PCV2復(fù)制及擴散提供最佳條件，病毒的體外增殖實驗中，只有當細胞已經(jīng)過有絲分裂期后病毒才開始復(fù)制。病毒在感染PCV的PK-15細胞內(nèi)主要以胞漿內(nèi)包涵體形式存在,少數(shù)感染細胞內(nèi)還可觀察到核內(nèi)包涵體[3]。

3.2 PK-15細胞傳代培養(yǎng)

提前15～20min在37℃溫水中加熱細胞培養(yǎng)液、PBS緩沖液、胰酶；點燃酒精燈；從37℃5%CO2培養(yǎng)箱中拿出已培養(yǎng)48h PK-15細胞的培養(yǎng)皿，棄掉原有的培養(yǎng)液；培養(yǎng)皿中加入5m1PBS，稍微搖動，棄掉液體；再加入5m1胰酶，放入37℃5%CO2培養(yǎng)箱中3min，棄掉胰酶，再放入37℃5%CO2培養(yǎng)箱中2～3min，拿出并輕拍皿沿 （觀察PK-15細胞掉落情況）；加6m1培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打并吹散細胞，分為3份，取一份放入新培養(yǎng)皿 （已提前放入8m1培養(yǎng)液）中培養(yǎng)，放入37℃5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48h。

4 PCV2病毒PCR檢測

4.1 提取病料的DNA

豬肺臟組織先打碎后研磨成勻漿，加入生理鹽水，制成組織懸液，離心，取上清液進行DNA提取。

（1）上清液中加入 20μ1Proteinase K溶液，混勻，加200μ1緩沖液GB，充分顛倒混勻，70℃放置10min，溶液應(yīng)變清亮，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。

（2）加入200μ1無水乙醇，充分振蕩混勻15s，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。

（3）將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB3中 （吸附柱CB3放入收集管中），12000r/min離心30s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。

（4）向吸附柱CB3中加入500μ1緩沖液GD，12000r/min離心30s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。

（5）向吸附柱CB3中加入600μ1漂洗液PW，12000r/min離心30s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中 （此操作重復(fù)2遍）。

（6）將吸附柱 CB3放回收集管中，12000r/min離心2min，倒掉廢液，將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。

（7）將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管中，向吸附膜中間部位懸空滴加60μ1洗脫緩沖液TE，室溫放置2～5min，12000r/min離心2min，將溶液收集到離心管中。

4.2 PCR檢測

（1）PCV2型病毒檢測引物：Forward：5’-AGTGAGCG GGAAAATGCAGA-3’； Reverse： 5’ -TCCTCCGTGGATTGTT CTGT-3’，此引物可以擴增出PCV2ORF1（開放式閱讀框，Open Reading Frame）中大小為391bp的DNA片段。

（2）檢測3組樣品，分別為病毒組、對照組和水。

20μ1PCR擴增反應(yīng)體系：

（3）PCR擴增程序如下：

反應(yīng)完畢后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，根據(jù)擴增片段大小，判定病毒感染情況。

5 PCV2病毒分離與鑒定

5.1 PK-15細胞傳代

按照3.2進行PK-15細胞傳代。

5.2 病毒接種

將PCR檢測結(jié)果為陽性的病料研磨后凍融3次，上清用0.22μm的細菌濾器過濾除菌。將已生長24h的PK-15細胞棄去原有培養(yǎng)液，加入5m1無血清培養(yǎng)液，將培養(yǎng)液與病毒濾液按體積比25∶1的比例進行混合，即5m1無血清培養(yǎng)液中加入200μ1病毒濾液，于37℃條件下培養(yǎng)2h，期間每半小時搖一次培養(yǎng)皿，幫助病毒附著到細胞上。2h后再加入無血清生長液繼續(xù)培養(yǎng)72h。培養(yǎng)過程中同時設(shè)立不接毒的細胞培養(yǎng)物作為陰性對照。

5.3 收集病毒

將接毒并培養(yǎng)72h后的PK-15細胞在-80℃反復(fù)凍融2次，20000r/min離心10min取上清液。

5.4 病毒傳代

5.4.1 傳代步驟

（1）用0.22μm細菌過濾器過濾病毒，放入新的離心管。

（2）吸出兩個PK-15細胞培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，用PBS清洗一遍。

（3）兩個PK-15細胞培養(yǎng)皿中各加5m1無血清培養(yǎng)液，取200μL病毒濾液接入其中一皿中，晃勻，放入37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中，每30min拿出搖一次。

（4）接入病毒2h后，棄掉培養(yǎng)液，重新加10m1無血清培養(yǎng)液，無病毒則直接再加5m1無血清培養(yǎng)液，放入37℃5%CO2培養(yǎng)箱中。

72h后，取第一代培養(yǎng)物 （F1）,再接種處于分裂期的PK-15細胞，同時設(shè)不接種病毒的PK-15細胞作陰性空白對照，連傳3代。傳代過程中PCR檢測PK-15細胞中PCV2增殖情況。

5.4.2 出現(xiàn)的問題及改進措施

實驗過程中，由于 （3）中接入的病毒濾液體積過少，導(dǎo)致病毒增殖較少，因此將 （3）中的200μ1病毒濾液改為500μ1病毒濾液。

5.5 PCV2病毒DNA的提取

按照步驟4.1.2提取PCV2病毒DNA。

5.6 PCR鑒定

以提取病毒DNA為模板，用PCV2型特異性檢測引物Forword/Reverse進行PCR鑒定。病毒通過電泳圖像顯示病原是否為陽性。

5.7 基因序列測定

PCV2 ORF1基因序列測定由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成。結(jié)合相關(guān)文獻資料，分析PCV2 ORF1基因的序列及所編碼的核苷酸，與己發(fā)表的基因序列比較同源性。

6 病毒提純

將收獲的病毒培養(yǎng)液在12000g離心30min，除去細胞碎片和較大的雜質(zhì)。將上清液加入盛有300g/L蔗糖墊的離心管中，150000g離心3h；棄去上清液，用0.01mmo1/L pH8.0的TE緩沖液重懸并收集病毒。

7 實驗結(jié)果

7.1 PK-15細胞的培養(yǎng)結(jié)果

經(jīng)過多次傳代的PK-15細胞生長狀況良好，增殖率高，參見圖1。

圖1 PK-15

7.2 接種病毒體積對于病毒增殖的影響

在病毒傳代時，最初無血清培養(yǎng)液與病毒濾液的體積比為25∶1，即5m1無血清培養(yǎng)液中接入200μ1病毒濾液，結(jié)果病毒增殖情況不理想。后改為無血清培養(yǎng)液與病毒濾液體積比為10∶1，即5m1無血清培養(yǎng)液中接入 500μ1病毒濾液，改變病毒濾液接入量后病毒增殖情況良好。

7.3 PCV2型特異性DNA片段的PCR檢測結(jié)果

采用病料中提取的DNA作為模板，用Forward,Reverse引物進行PCR擴增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢查擴增的PCR產(chǎn)物，結(jié)果獲得一條長度為417bp的電泳條帶，擴增產(chǎn)物結(jié)果與預(yù)期片段大小相符，說明病料組織中含有PCV2，參見圖2。

7.4 病毒分離培養(yǎng)結(jié)果

將PCR檢測陽性的組織勻漿接種于PK-15細胞，進行3次傳代。結(jié)果表明，F(xiàn)1～F3病毒用PCV2型特異性引物均可擴增獲得PCV2的特異性目的片段，說明病毒已在PK-15細胞中增殖。病毒通過電泳圖像均顯示陽性，見圖3，說明病毒培養(yǎng)成功。

圖3 病毒電泳條帶結(jié)果

7.5 序列測定與分析結(jié)果

7.5.1 PCV2毒株ORF1基因的測序結(jié)果

PCV2毒株ORF1基因的測序結(jié)果見下。經(jīng)測序：PCV2的ORF1基因序列為391個堿基組成，大小和預(yù)期結(jié)果一致。

7.5.2 PCV2毒株核苷酸序列比較結(jié)果 （相同核苷酸用 “……”表示）。

結(jié)果顯示，PCV2的ORF1基因核苷酸序列和國內(nèi)己發(fā)表毒株ORF1基因相比較，核苷酸序列同源性為94.6%。

8 結(jié)論

PK-15細胞是體外培養(yǎng)PCV2病毒的敏感細胞，把PCV2接種到無PCV感染的PK-15細胞上能獲得最好的病毒增殖，但不產(chǎn)生細胞病變。在病毒傳代時通過改變無血

清培養(yǎng)液與病毒濾液的比例，得出無血清培養(yǎng)液與病毒濾液體積比為10∶1時病毒增殖情況較好。

將PCR檢測呈陽性的病料接種到PK-15細胞連續(xù)傳代，接種后1～3代細胞培養(yǎng)物用PCV2型特異性引物檢測結(jié)果呈陽性，說明PCV2病毒己在PK-15細胞中增殖。最后將病毒純化分離，進行測序鑒定，從而確定其為PCV2分離株。

本實驗根據(jù)PCV2的培養(yǎng)特性，使其在適應(yīng)細胞PK-15上成功繁殖并傳代，達到從原始病料中分離病毒的目的。

9 研究前景

PCV2感染和引起的疾病己成為全球養(yǎng)豬生產(chǎn)中的大問題。目前，各國對PCV2感染沒有有效的防治方法，普遍采取的措施是控制繼發(fā)感染，在做好豬場的衛(wèi)生消毒工作、降低或避免應(yīng)激因素、提高飼養(yǎng)管理水平和斷奶仔豬營養(yǎng)水平的基礎(chǔ)上，重點控制繼發(fā)感染，最大限度地降低死亡率，減少經(jīng)濟損失。本實驗通過PK-15細胞分離鑒定了一株P(guān)CV2病毒株，用此病毒株再進行數(shù)次傳代培養(yǎng)，不斷弱化其毒性，可作為活疫苗使用，為以后開發(fā)PCV2的弱毒活疫苗奠定基礎(chǔ)。

[1]丁婷婷.豬圓環(huán)病毒2型的分離鑒定及其人工感染試驗[D].揚州:揚州大學(xué),2012.

[2]盧權(quán)威,郭官鵬,崔保安,等.2株豬圓環(huán)病毒2型的分離鑒定及全基因組序列分析[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）,2013,9(3):44-48.

[3]王永祥.豬圓環(huán)病毒2型山東株的分離鑒定及其DRF2基因的克隆與表達[D],濟南:山東農(nóng)業(yè)大學(xué),2008.