趙 欣 白 偉

(1.陜西國際商貿(mào)學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院，西安 712046； 2.西安聯(lián)創(chuàng)生物醫(yī)藥孵化器有限公司，西安 710065)

在干旱與半干旱地區(qū)，水資源短缺是影響植物生理生態(tài)和生長發(fā)育的最主要的逆境脅迫因子，大約50%的農(nóng)業(yè)減產(chǎn)均由干旱所致[1]。1/3的地表面積屬于干旱地區(qū)，這一數(shù)值正在加大，據(jù)美國紐約市立大學(xué)國家環(huán)境預(yù)報中心的研究發(fā)現(xiàn)，隨著環(huán)境尾氣排放的不斷增加，全球氣候的變暖，世界干旱地區(qū)的面積將至少增加8%[2]。植物為應(yīng)對干旱環(huán)境，植物體內(nèi)會發(fā)生多種生理生化反應(yīng)，以保持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)。如葉片的光合作用和蒸騰作用，是評價植物耐旱性的兩個重要生理生態(tài)過程，干旱脅迫下，氣孔的開合是調(diào)節(jié)植物光合速率和蒸騰速率的主要途徑[3]。另外，植物可通過提高體內(nèi)的一些保護(hù)酶活性(如SOD、POD、CAT)，將體內(nèi)過多的活性氧加以清除，從而減少因活性氧攻擊細(xì)胞膜而產(chǎn)生的丙二醛含量；同時，干旱脅迫也會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量上升，從而使胞內(nèi)水勢降低，保持水分不流失[4～5]。另一方面，植物在分子水平上也會發(fā)生一系列反應(yīng)，以響應(yīng)干旱脅迫，如干旱相關(guān)基因表達(dá)水平的變化，導(dǎo)致蛋白質(zhì)水平發(fā)生改變，最終使植物的各個生物學(xué)過程與干旱脅迫處理前有所差異，以應(yīng)對干旱環(huán)境[6]。然而，大部分干旱響應(yīng)相關(guān)基因數(shù)量十分有限，基因的功能更未得到精確鑒定，植物干旱響應(yīng)相關(guān)的基因信息仍然有限[7]。蛋白質(zhì)是生命活動的直接執(zhí)行者，由于從基因到蛋白質(zhì)，需要經(jīng)歷轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾等過程，導(dǎo)致基因組、轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組之間存在信息差，從而影響細(xì)胞內(nèi)包括蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)、蛋白質(zhì)活性、蛋白質(zhì)定位等在內(nèi)的多種重要生物學(xué)過程[8]。因此，比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在植物干旱應(yīng)答機(jī)制研究中的廣泛應(yīng)用，可對其分子機(jī)制的進(jìn)行深度解析[8]。

杜仲是中國特有的落葉喬木，屬杜仲科杜仲屬。杜仲皮和葉干燥以后，可以入藥，是一種名貴中藥材，同時也是工業(yè)橡膠的原料。杜仲在我國分布廣泛，由于其主根深、側(cè)根發(fā)達(dá)、須根系龐大等特點，具有較強(qiáng)的水土保持能力。因此是山區(qū)發(fā)展經(jīng)濟(jì)林的重要樹種，同時可以用于綠化和水土保持，特別是陜北黃土丘陵區(qū)[9]。當(dāng)前，對杜仲的研究，主要集中在其藥理作用、成分分析、栽培管理等方面，對干旱脅迫下杜仲的生理生化響應(yīng)機(jī)制也有涉及，如干旱脅迫對杜仲葉片光合作用、水飽和虧、過氧化物酶活性等的影響研究[3～5]。但是，對于干旱脅迫下杜仲的分子響應(yīng)機(jī)制研究較少，對于杜仲干旱響應(yīng)關(guān)鍵蛋白的篩選和鑒定的研究更是鮮有報導(dǎo)。因此，本研究擬對干旱脅迫下的杜仲葉片差異蛋白質(zhì)組變化進(jìn)行研究，同時分析干旱脅迫3、6、9、12、15 d以及復(fù)水后2 d葉片的光合特征、SOD活性、POD活性、CAT活性、脯氨酸含量、可溶性糖含量、丙二醛含量和水分飽和虧，以了解杜仲響應(yīng)干旱脅迫的生理生化和分子機(jī)制，為利用杜仲的優(yōu)質(zhì)抗旱基因提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料的培養(yǎng)與處理

1.2 生理生化指標(biāo)測定

1.2.1 葉片水分飽和虧

參照謝寅峰等[10]的方法進(jìn)行。

1.2.2 光合參數(shù)的測定

利用Li-6400便攜式光合測定儀(美國LI-COR Biosciences公司)，測定不同處理時間下杜仲葉片的凈光合速率、蒸騰速率、胞間CO2濃度、氣孔導(dǎo)度。光合有效輻射強(qiáng)度設(shè)定為1 400 μmol·m-2·s-1，光源為人工光源，使用空氣CO2濃度。

1.2.3 保護(hù)酶活性測定

超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)酶液的制備和酶活測定參照劉紅云等[4]的方法進(jìn)行。

1.2.4 丙二醛、脯氨酸、可溶性糖含量測定

鑒于此，本研究針對紙漿洗滌過程的特點，充分利用生產(chǎn)過程長期運行積累的工業(yè)數(shù)據(jù)，基于兩步神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法得到殘堿和黑液波美度的預(yù)測模型，通過這兩大指標(biāo)構(gòu)建紙漿洗滌質(zhì)量評價模型，對工業(yè)運行數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類、模式匹配，構(gòu)建出優(yōu)化模式庫。以最優(yōu)生產(chǎn)為目標(biāo)，對優(yōu)化模式庫進(jìn)行操作模式尋優(yōu)，匹配出最優(yōu)操作模式。通過實驗驗證該方法能有效預(yù)測紙漿洗滌過程的狀態(tài)參數(shù)，達(dá)到優(yōu)化生產(chǎn)的效果。

丙二醛含量測定參照Hodges等[11]的方法進(jìn)行；脯氨酸含量測定參照Bates等[12]的方法進(jìn)行；可溶性糖含量測定參照Farhad等[13]的方法進(jìn)行。

1.3 杜仲葉片蛋白質(zhì)雙向電泳分離、差異蛋白MALDI-TOF-TOF生物質(zhì)譜鑒定

杜仲葉片總蛋白提取參照Liu等[14]的方法進(jìn)行，將獲得的蛋白干粉溶解于適量的裂解緩沖液(7 mol·L-1尿素，2 mol·L-1硫脲、4% CHAPS、65 mmol·L-1Dithiothreitol(DTT)、微量蛋白質(zhì)抑制劑)中，置于冰上2 h，然后在4℃，19 000 g·min-1轉(zhuǎn)離心1 h，取上清。采用Liu等[14]的方法對上清液進(jìn)行蛋白濃度測定。將獲得蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行雙向電泳分離，并對2-DE膠圖進(jìn)行pdquest 8.0軟件分析，找出差異蛋白點，并對差異蛋白進(jìn)行生物質(zhì)譜鑒定，操作步驟參考Liu等[14]的方法進(jìn)行。參考的數(shù)據(jù)庫為NCBI綠色植物庫(taxid:33090；336070 protein sequences；20170113)，蛋白質(zhì)評分C.I.%超過95%以上的蛋白質(zhì)認(rèn)定為鑒定成功的蛋白。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫對杜仲葉片中生理生化指標(biāo)的影響

極端干旱環(huán)境中的植物，如果長時間得不到水分補(bǔ)償，會導(dǎo)致長期水分虧缺，從而影響到植物的正常生理代謝活動。因此，水分飽和虧是反應(yīng)植物對干旱耐受程度的重要指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)，杜仲葉片水飽和虧隨著水分脅迫處理時間的延長而增加，在處理第15 d時，水分飽和虧達(dá)到最大值，為55.19%，而復(fù)水后的水分飽和虧降為6.93%(表1)。結(jié)果表明，杜仲在持續(xù)性干旱脅迫下具有一定的自我調(diào)節(jié)能力。

由表1可以看出，隨干旱脅迫脅迫時間的延長，杜仲葉片的光合速率、蒸騰速率、胞間二氧化碳濃度、氣孔導(dǎo)度均逐漸降低，特別是在干旱處理第15 d，杜仲葉片的光合速率、蒸騰速率、胞間二氧化碳濃度、氣孔導(dǎo)度平均值比對照(0 d)分別降低了86.78%、91.61%、76.00%、94.07%。結(jié)果表明，為適應(yīng)水分虧缺環(huán)境，杜仲葉片的蒸騰耗水量顯著降低，同時，杜仲葉片的氣孔會關(guān)閉，使氣孔導(dǎo)度顯著降低，胞間二氧化碳濃度達(dá)不到光合作用所需，從而導(dǎo)致光合速率顯著下降，而且干旱脅迫時間越長，影響越大。因此，氣孔關(guān)閉是影響干旱脅迫下杜仲葉片光合作用和蒸騰作用的主要原因。

SOD、POD、CAT是生物體內(nèi)清除活性氧等自由基的重要保護(hù)酶，與植物耐旱性能呈正相關(guān)關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，杜仲葉片中SOD、POD、CAT活性隨著干旱脅迫時間的延長，出現(xiàn)先上升后下降的趨勢，特別是在處理15 d時，3種保護(hù)酶活性顯著下降，表明持續(xù)干旱導(dǎo)致杜仲所受的傷害加重，超出自身耐受能力，并使保護(hù)酶活性下降，抗氧化能力減弱。復(fù)水后，與干旱處理15 d相比，杜仲葉片的保護(hù)酶活性下降。

丙二醛是細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其含量越高，表明細(xì)胞受傷害程度越大。表1結(jié)果表明，在干旱處理前期(前6 d)，杜仲葉片中丙二醛含量逐漸上升，但是在處理第7～12 d，丙二醛含量呈下降趨勢，然而在處理第12天以后，丙二醛含量顯著上升。結(jié)果表明，干旱處理早期，杜仲葉片細(xì)胞膜系統(tǒng)受到損害，為減少傷害，杜仲自身會啟動保護(hù)酶防御系統(tǒng)， 因而在處理7～12 d時， 葉片丙二醛含量逐漸降低。但是在處理第12 d以后，干旱脅迫程度已經(jīng)超過杜仲自身的耐受限度，保護(hù)酶系統(tǒng)遭到破壞，增強(qiáng)了膜脂質(zhì)過氧化程度，導(dǎo)致丙二醛含量再次上升。在復(fù)水后，杜仲葉片中的丙二醛含量降低至28.73 mmol·g-1，仍維持在較高水平，表明持續(xù)性干旱脅迫已對杜仲造成不可修復(fù)的損傷。

表1 干旱脅迫下杜仲葉片生理生化指標(biāo)測定結(jié)果

注：FW.鮮重；SOD.超氧化物歧化酶；POD.過氧化物酶；CAT.過氧化氫酶；MDA.丙二醛 數(shù)字右上方字母相同的，表示無顯著性差異，不同字母表示顯著性差異，差異水平設(shè)置為P<0.05。

Note：FW. Fresh weight；SOD. Superoxide dismutase；POD. Peroxidase；CAT. Catalase；MDA. Malondialdehyde Mean values with the same letters in the same indices indicate non-significant difference,and means with different letters show significant difference atP<0.05 level.

通常情況下，干旱處理后的植物組織細(xì)胞中，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸和可溶性糖含量會顯著上升，以降低胞內(nèi)滲透勢從而減少水分損失。從表1中可以看出，杜仲葉片中脯氨酸和可溶性糖含量在干旱處理前期，含量逐漸上升，在處理第12 d時達(dá)到最大值，分別為151.48 μg·g-1、14.71%，結(jié)果表明，杜仲葉片可以通過提升胞內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸和可溶性糖含量來應(yīng)對干旱脅迫。但是在干旱脅迫處理第15 d時，兩者含量顯著下降，表明杜仲的干旱耐受能力有限，超過一定的時期，會造成杜仲不可逆轉(zhuǎn)的損傷。在復(fù)水后，杜仲葉片中脯氨酸和可溶性糖水平下降，但是仍不能恢復(fù)到處理前(0 d)水平。

2.2 干旱脅迫對杜仲葉片中蛋白質(zhì)組的影響

各種生理指標(biāo)測定結(jié)果表明，杜仲葉片在干旱處理第15天時呈現(xiàn)最大傷害程度，為解析杜仲葉片在此條件下的分子響應(yīng)機(jī)制，將0 d和處理15 d的杜仲葉片的蛋白質(zhì)，通過雙向電泳分離，分別檢測到594、617個重復(fù)性較好的蛋白點(圖1)，其中1.5倍以上的差異表達(dá)蛋白點有36個(P<0.05)。經(jīng)MALDI-TOF-TOF生物質(zhì)譜鑒定和數(shù)據(jù)庫比對，36個差異蛋白點均被鑒定成功，其中22個蛋白點豐度在干旱處理后上升，14個蛋白點豐度下降(表2)。通過功能富集分析，這些差異蛋白質(zhì)涉及干旱脅迫信號感應(yīng)和傳導(dǎo)、光合作用、碳水化合物代謝、次生代謝物的合成、氨基酸生物合成、能量代謝、蛋白質(zhì)生物合成，以及活性氧等自由基清除等(圖2:A)，其中上調(diào)表達(dá)的蛋白質(zhì)主要參與信號傳導(dǎo)、碳水化合物代謝、能量代謝、活性氧清除、氨基酸生物合成，光合作用、蛋白質(zhì)生物合成、次生代謝物的合成等生物學(xué)過程相關(guān)蛋白則下調(diào)表達(dá)(表2)。從亞細(xì)胞定位結(jié)果可知，所鑒定的差異蛋白大部分定位于葉綠體(55%)中，其次是細(xì)胞質(zhì)中(31%)(圖2:B)，表明光合作用相關(guān)蛋白受干旱脅迫影響最大。

圖2 干旱脅迫下杜仲葉片差異蛋白的功能分類及亞細(xì)胞定位結(jié)果 A.差異蛋白的功能分類；B.差異蛋白的亞細(xì)胞定位Fig.2 Distribution representation of the identified proteins based on their function and subcellular localizationA.Function classification of the differential expressed proteins; B.Subcellular localization of the differential expressed proteins

點編號Spot No.蛋白描述Protein Description登錄號Accession物種Species蛋白得分Protein score實驗值Experimental理論值Theoretical分子量Mass(kDa)等電點pI分子量Mass(kDa)等電點pIFCPMCR1核糖體蛋白L22ribosomal protein L22ANP25540.1杜仲E.ulmoides37959.215.1654.7910.06-3.1843592ATP合酶CF1 α亞基ATP synthase CF1 alpha subunitANP25499.1杜仲E.ulmoides21853.625.1855.195.342.2423483黃酮醇合酶flavonol synthasegi|477542029杜仲E.ulmoides18641.075.5238.035.59-2.5228534ATPase α亞基ATPase alpha subunitgi|89112874杜仲E.ulmoides19148.136.0446.226.214.72244553-羥基-3-甲基戊二烯輔酶A合酶3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthasegi|1160524372杜仲E.ulmoides15250.715.2551.695.77-2.2120626Rubisco大亞基ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunitgi|1041926818杜仲E.ulmoides11252.896.1853.346.33-2.0134717乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶acetyl-CoA acetyltransferasegi|1160524370杜仲E.ulmoides20835.215.1442.948.92-2.6118428乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶acetyl-CoA acetyltransferasegi|1160524370杜仲E.ulmoides10229.595.2142.948.92-3.428279光捕獲類蛋白3light harvesting-like protein 3gi|290782564杜仲E.ulmoides9812.365.929.126.38-1.72919101-脫氧基-D-5-磷酸核酮糖合酶1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthasegi|408833344杜仲E.ulmoides10466.485.8776.968.14-3.13122111S-腺苷甲硫氨酸合酶3S-adenosylmethionine synthase 3gi|743783202胡楊Populus euphratica17834.605.4743.245.502.33205212磷酸甘油酸激酶phosphoglycerate kinaseXP_016702717.1陸地棉Gossypium hirsutum23150.174.2951.238.742.25112113谷氨酰胺合成酶glutamine synthetase leaf isozymegi|255551511蓖麻Ricinus communis35251.086.4949.846.574.871324142磷酸核酮糖脫羧/加氧酶活化酶ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase activase,chloroplastic isoform X2gi|747060719芝麻Sesamum indicum13546.046.3247.606.78-2.93235115RNA聚合酶α鏈RNA polymerase alpha chaingi|1041926828杜仲E.ulmoides10632.836.5637.556.51-1.93142616烯醇酶Enolasegi|743896837胡楊P.euphratica11044.385.1947.915.675.53111917磷酸甘油酸變位酶2,3-bisphosphoglycerate-independent phosphoglycerate mutasegi|922339631蒺藜狀苜蓿Medicago truncatula20247.035.0250.575.452.52216218生長素結(jié)合蛋白1auxin-binding protein 1gi|46409853杜仲E.ulmoides16025.015.8821.455.663.82183719富胚胎發(fā)育晚期蛋白Dc3late embryogenesis abundant protein Dc3gi|702484246巨桉Eucalyptus grandis25514.216.5314.106.164.3994520Rubisco大亞基ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit,partialgi|766946891杜仲E.ulmoides18432.174.3429.239.1610.85132821Rubisco大亞基ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit,partialgi|343186353杜仲E.ulmoides26220.105.5421.985.783.61163722鐵氧還蛋白-NADP還原酶ferredoxin-NADP reductasegi|1000938423蓖麻R.communis25840.624.8840.858.80-2.841843232-磷酸果糖醛縮酶1fructose-bisphosphate aldolase 1gi|743793523胡楊P.euphratica11955.126.1242.868.132.76133524光系統(tǒng)IIcp47蛋白photosystem II cp47 protein,partialgi|335060099杜仲E.ulmoides9460.156.7568.326.64-4.9282325過氧化物酶aperoxidase agi|51511062杜仲E.ulmoides23536.144.7336.018.108.531443

續(xù)表2Continuedtable2

點編號Spot No.蛋白描述Protein Description登錄號Accession物種Species蛋白得分Protein score實驗值Experimental理論值Theoretical分子量Mass(kDa)等電點pI分子量Mass(kDa)等電點pIFCPMCR26磷酸丙糖異構(gòu)酶triosephosphate isomerasegi|1002246204甜椒Capsicum annuum27729.125.2427.095.722.71185427L-抗壞血酸過氧化物酶L-ascorbate peroxidasegi|823153064雷蒙德氏棉Gossypium raimondii14527.895.3527.535.593.01125328磷酸核酮糖激酶Phosphoribulokinasegi|743809191胡楊P.euphratica15542.765.6244.966.032.55226429甘氨酸脫氫酶glycine dehydrogenasegi|823234381雷蒙德氏棉G.raimondii397110.286.27113.926.505.81295830β-葡糖苷酶12類前體beta-glucosidase 12-like precursorgi|658309748蘋果Malus domestica17862.145.4860.905.564.372853316-磷酸葡萄糖脫氫酶glucose-6-phosphate dehydrogenaseBAK22407.1本氏煙Nicotiana benthamiana9560.056.1758.596.09-3.18132932碳酸酐酶carbonic anhydrase,chloroplastic isoform X3gi|1111061574野生煙草Nicotiana attenuate17625.526.0129.195.922.84164933抗壞血酸過氧化物酶1cytosolic ascorbate peroxidase 1gi|148912162陸地棉G.hirsutum11226.615.7527.595.933.12114334RNA結(jié)合蛋白CP31BRNA-binding protein CP31BJAU51823.1天藍(lán)遏藍(lán)菜Noccaea caerulescens11929.884.8132.704.82-3.331459352-Cys過氧化物還原酶BAS12-Cys peroxiredoxin BAS1gi|255578581蓖麻R.communis9641.514.7129.308.385.0274736[Cu-Zn]超氧化物歧化酶superoxide dismutase[Cu-Zn]gi|747082905芝麻S.indicum10523.175.8222.865.892.881053

注：FC.變化倍數(shù)；PM.匹配肽段數(shù)；CR.覆蓋率

Note：FC.Fold Change；PM.Peptides matched；CR.Coverage rate

3 討論

3.1干旱脅迫下杜仲葉片生理生化變化

研究發(fā)現(xiàn)，在水分飽和虧達(dá)到46.2%時，杜仲葉片會發(fā)生萎蔫現(xiàn)象，而達(dá)到50%以上，則可發(fā)現(xiàn)葉片枯黃，表明此時干旱脅迫已對杜仲產(chǎn)生重度干旱脅迫[4]。本研究發(fā)現(xiàn)，在干旱處理15 d后的杜仲葉片，水分飽和虧達(dá)到55.19%(表1)，表明此時，干旱脅迫已導(dǎo)致杜仲葉片重度干旱損傷。差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究亦選取此時的葉片進(jìn)行研究，以篩選和分析重度干旱脅迫下杜仲葉片干旱脅迫響應(yīng)相關(guān)蛋白及其機(jī)制。

隨著干旱處理時間的延長，對杜仲造成的脅迫程度加劇，葉片凈光合速率和蒸騰速率均以對照(0 d)為最大。氣孔導(dǎo)度和胞間二氧化碳濃度也隨著干旱脅迫時間的延長而逐漸顯著降低(表1)。氣孔的關(guān)閉是通過調(diào)節(jié)葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞的運動來實現(xiàn)的[3]，由表1結(jié)果表明，杜仲為適應(yīng)干旱環(huán)境，植株會降低氣孔導(dǎo)度，降低CO2的交換速度和濃度，維持較低的光合速率和蒸騰速率，從而降低能量和水分的損耗。因此，氣孔限制是影響干旱脅迫下杜仲葉片光合作用的主要原因。

正常的植株體內(nèi)，活性氧等自由基的含量水平處于一個動態(tài)平衡狀態(tài)，在逆境脅迫中，活性氧還能起到信號傳導(dǎo)的作用，然而，若過度的逆境脅迫，將會破壞自由基的平衡狀態(tài)，從而攻擊細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)、核酸等，造成植物組織細(xì)胞因代謝紊亂而損傷[3]。活性氧的清除，需要依靠一些抗氧化保護(hù)酶如SOD、POD、CAT等的作用[3]。丙二醛是細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，其含量高低可以反映逆境脅迫導(dǎo)致膜損傷的程度[15]。在干旱處理前期(6 d)，杜仲葉片中丙二醛含量逐漸上升，表明抗氧化酶還未完全發(fā)揮作用，雖然SOD、POD、CAT活性從干旱處理開始就逐漸上升(表1)。但是在處理第7～12 d，丙二醛含量逐漸下降，表明抗氧化保護(hù)酶已發(fā)揮其作用，尤其是POD和CAT的活性，分別由處理前的482.59和229.61 U·g-1·min-1增加至2 847.26和4 234.35 U·g-1·min-1(表2)。這一結(jié)果與Ge等[16]、劉紅云等的結(jié)果一致[3]。

滲透調(diào)節(jié)是植物抵御逆境脅迫的一種重要方式，不同植物物種，因為基因型、蛋白譜等的差異，在響應(yīng)逆境脅迫過程中，細(xì)胞內(nèi)累積的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)也不一致[17]。研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)性干旱脅迫導(dǎo)致杜仲葉片中脯氨酸和可溶性糖含量顯著上升，在復(fù)水后，含量有所下降(表1)。結(jié)果表明，脯氨酸和可溶性糖是杜仲葉片中重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，以降低其在干旱環(huán)境中的水分損失，從而維持植物體內(nèi)穩(wěn)態(tài)，這與劉紅云等[3]的研究結(jié)果類似。

3.2 干旱處理對杜仲葉片蛋白質(zhì)的影響

根據(jù)逆境脅迫的強(qiáng)度和持續(xù)時間，可將植物響應(yīng)逆境脅迫過程分為四個階段[18]：起始預(yù)警階段(initial alarm phase)，該階段會導(dǎo)致植物的快速應(yīng)激反應(yīng)，使植物的抗逆能力下降；第二階段為適應(yīng)階段(acclimation phase)，并持續(xù)數(shù)天，此時植物會發(fā)生各種生理生化代謝反應(yīng)，以建立一個新的內(nèi)穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)；第三階段為維持期(maintenance phase)，新建立的內(nèi)穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)在該階段會維持在一個較穩(wěn)定的水平；如果逆境脅迫強(qiáng)度過大或者持續(xù)時間過長，植物無法維持其建立的新的內(nèi)穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)，將會進(jìn)入衰退期(recession phage)，導(dǎo)致植物各種生物學(xué)代謝過程紊亂。每一個階段對應(yīng)植物不同的蛋白質(zhì)組成[19]。

3.2.1 干旱對杜仲葉片信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白的影響

植物響應(yīng)干旱脅迫的第一步是感應(yīng)和傳導(dǎo)脅迫信號，繼而引發(fā)植物響應(yīng)逆境脅迫的四個反應(yīng)階段。在干旱處理后的杜仲葉片中，有2個蛋白涉及信號傳導(dǎo)，即生長素結(jié)合蛋白1(ABP1，蛋白點18，表2)和β-葡糖苷酶12類前體(蛋白點30)，ABP1蛋白定位于細(xì)胞壁，并在逆境脅迫中起到信號傳導(dǎo)的作用[20]。ABP1基因在干旱脅迫下的玉米中的上調(diào)表達(dá)，可使玉米生長受限，以抵御缺水環(huán)境[21]。葡糖苷酶在逆境脅迫中可以通過生氰作用，催化葡萄糖苷的水解，繼而激發(fā)各種活性激素的產(chǎn)生，包括細(xì)胞激素、赤霉素和生長素，從而將逆境信號傳遞至胞內(nèi)[22]。ABP1和葡糖苷酶在干旱處理后的杜仲葉片中上調(diào)表達(dá)，表明杜仲可通過調(diào)控葉片中生長素水平，調(diào)節(jié)植物生長以適應(yīng)干旱缺水環(huán)境。

3.2.2光合作用、碳代謝、能量代謝相關(guān)蛋白在干旱處理的杜仲葉片中的變化

光合作用是植物體內(nèi)碳水化合物合成的主要生物學(xué)過程，對植物細(xì)胞生長和增殖及其重要，主要包括兩個反應(yīng)階段，即光反應(yīng)階段(光捕獲)和暗反應(yīng)階段(卡爾文循環(huán))，保持穩(wěn)定光合速率對維持植物在逆境脅迫中的生長具有重要意義[14]。本研究發(fā)現(xiàn)共有7個蛋白參與干旱脅迫下杜仲葉片的光合作用(表2)，其中2個上調(diào)表達(dá)(蛋白點20與21)，5個下調(diào)表達(dá)(蛋白點6、9、14、22、24)。光捕獲蛋白3(蛋白點9)、NADPH-鐵氧還蛋白還原酶(蛋白點22)與光系統(tǒng)IIcp47蛋白(蛋白點24)參與光反應(yīng)階段，其中NADPH-鐵氧還蛋白還原酶可催化電子從NADPH轉(zhuǎn)移至鐵氧還蛋白的反應(yīng)，并產(chǎn)生質(zhì)子(H+)和電子勢，是光合反應(yīng)過程的限速步驟之一[14]。這三個蛋白在干旱脅迫下的杜仲葉片中下調(diào)表達(dá)(表2)，表明持續(xù)性干旱脅迫已導(dǎo)致杜仲葉片光合電子傳遞鏈?zhǔn)艿斤@著抑制，從而導(dǎo)致過量的激發(fā)態(tài)能量被轉(zhuǎn)移至活性氧的產(chǎn)生過程，從而導(dǎo)致氧化脅迫，這與Ghosh等[23]的推論一致。其余的4個蛋白點主要參與碳固定(卡爾文循環(huán))階段，包括1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶大亞基(Rubisco，蛋白點6,20,21)與1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶活化酶(Rubisco活化酶，蛋白點14)。Rubisco可以催化CO2與二磷酸核酮糖反應(yīng)形成3-磷酸甘油酸，繼而起始碳水化合物代謝反應(yīng)，其中CO2是加氧反應(yīng)的競爭性抑制子，而O2則是羧化反應(yīng)的競爭性抑制子[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，蛋白點6的分子量(52.89 kDa)要顯著大于蛋白點20(32.17 kDa)和蛋白點21(20.10 kDa)，而蛋白點6在干旱脅迫后的杜仲葉片中下調(diào)表達(dá)，蛋白點20與21則上調(diào)表達(dá)，表明蛋白點20與21是蛋白點6的降解片段，Rubisco酶在持續(xù)性干旱脅迫后的杜仲葉片中遭到破壞，影響杜仲葉片的光合作用，這與楊樹葉片響應(yīng)干旱脅迫的機(jī)制一致[24]。Rubisco活化酶基因通過可變剪輯，可表達(dá)形成兩種亞型，且起不同作用的蛋白，它們的分子量分別在41～43與45～46 kDa，分子量較大的亞型主要通過調(diào)節(jié)細(xì)胞基質(zhì)中氧化還原態(tài)，調(diào)控逆境脅迫中植物的光合作用，而小亞型則通過保持逆境脅迫下植物中Rubisco活性來適應(yīng)脅迫環(huán)境[25]。本研究中Rubisco活化酶(蛋白點14)的分子量為46.06，屬分子量較大的亞型，它的下調(diào)表達(dá)表明持續(xù)性干旱導(dǎo)致杜仲葉片氧化還原穩(wěn)態(tài)遭到破壞，使其光合作用受到抑制。在生理生化指標(biāo)分析過程中，也發(fā)現(xiàn)干旱處理可導(dǎo)致杜仲葉片氣孔的關(guān)閉，降低蒸騰作用，減少水分損失，同時葉片對外界CO2的吸收也降低，最終導(dǎo)致杜仲葉片光合速率降低(表1)。綜上所述，持續(xù)性干旱缺水環(huán)境，導(dǎo)致Rubisco酶和Rubisco活化酶活性受到影響，并抑制杜仲葉片光合作用。

碳水化合物代謝是繼光合作用以后，最易受干旱影響的生物學(xué)過程，它包括糖酵解、三羧酸循環(huán)、磷酸戊糖途徑。糖酵解/糖質(zhì)新生可將葡萄糖轉(zhuǎn)化為丙酮酸和H+，并將產(chǎn)生的能量以ATP和NADH的形式儲存；三羧酸循環(huán)是將丙酮酸在有氧的情況下降解形成CO2和水，并產(chǎn)生能量ATP供植物正常生長和分化所需，同時，也可產(chǎn)生一些體內(nèi)物質(zhì)合成過程中所需的前體物質(zhì)；磷酸戊糖途徑是糖酵解途徑中的一個旁路，產(chǎn)生5-磷酸核糖和NADPH，為代謝物生物合成提供基體物質(zhì)和還原力[26]。本研究供發(fā)現(xiàn)有6個蛋白參與糖酵解途徑，其中5個蛋白在干旱處理后的杜仲葉片中上調(diào)表達(dá)，包括磷酸甘油酸激酶(蛋白點12)、烯醇酶(蛋白點16)、磷酸甘油酸變位酶(蛋白點17)、二磷酸果糖醛縮酶1(蛋白點23)、磷酸丙糖異構(gòu)酶(蛋白點26)，只有一個蛋白下調(diào)表達(dá)，即6-磷酸葡萄糖激酶(蛋白點31)。另外，有1個蛋白參與杜仲葉片的磷酸戊糖途徑，且在干旱處理后上調(diào)表達(dá)，磷酸核酮糖激酶(蛋白點28)。本次實驗沒有發(fā)現(xiàn)三羧酸循環(huán)相關(guān)蛋白。結(jié)果表明，持續(xù)性干旱脅迫下的杜仲葉片中，糖酵解和磷酸戊糖途徑得到增強(qiáng)，這可能是杜仲葉片中可溶性糖含量在干旱處理后上升(表1)的主要原因。

糖酵解、三羧酸循環(huán)、磷酸戊糖途徑伴隨著能量的代謝。本研究共發(fā)現(xiàn)有2個能量代謝相關(guān)蛋白，包括ATP合酶CF1α亞基(蛋白點2)和ATPaseα亞基(蛋白點4)，它們在干旱脅迫后的杜仲葉片中含量上升。ATPase是質(zhì)膜和細(xì)胞器內(nèi)膜系統(tǒng)的內(nèi)嵌蛋白，包括Na+、K+、H+-ATPase，是植物體內(nèi)能量代謝的關(guān)鍵酶；ATP合酶CF1α亞基是線粒體內(nèi)Ca2+結(jié)合型的特異性蛋白，其產(chǎn)生的ATP作為能量物質(zhì)，可維持膜上鈣泵活性所需，并可調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)中Ca2+濃度[27]。能量代謝相關(guān)蛋白的上調(diào)表達(dá)，表明杜仲葉片在干旱脅迫下能量代謝得到增強(qiáng)。

綜上所述，持續(xù)性干旱脅迫對杜仲葉片的光合作用產(chǎn)生負(fù)面影響，但是可以通過糖酵解途徑和磷酸戊糖途徑生產(chǎn)的ATP、NADPH等能量物質(zhì)，以維持其在干旱環(huán)境中的生長所需。

3.2.3干旱脅迫下杜仲葉片次級代謝物合成相關(guān)蛋白的變化

杜仲葉中富含萜類物質(zhì)，是杜仲膠的主要成分，細(xì)胞質(zhì)的甲羥戊酸(Mevalonate,MVA)途徑和質(zhì)體的脫氧木酮糖-5-磷酸(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate pathway，DXP)途徑是萜類物質(zhì)合成的兩個重要途徑[28]。在MVA途徑中，乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶(蛋白點7與8)是其中的一個關(guān)鍵酶，屬Ⅱ型硫解酶[29]，它們在干旱處理后的杜仲葉片中下調(diào)表達(dá)(表2)。3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶(蛋白點5)是MVA途徑的另一關(guān)鍵限速酶，它可催化3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A，然后經(jīng)3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶的催化作用，形成甲羥戊酸[28]，缺水處理同樣導(dǎo)致3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶在杜仲葉片中的表達(dá)量下降(表2)。脫氧木酮糖-5-磷酸合酶(蛋白點10)是DXP合成過程中的關(guān)鍵酶，然后經(jīng)2-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(MEP)途徑合成帖類物質(zhì)[30]，該酶在干旱處理后的杜仲葉片中的表達(dá)比對照下降3.13倍(表2)。結(jié)果表明，干旱處理導(dǎo)致杜仲葉片的萜類物質(zhì)的合成受限，引起了杜仲的中藥成分變化。

黃酮類化合物是一類具有抗氧化、抗腫瘤活性的多酚類次級代謝物，廣泛存在于植物中，黃酮醇是其中較重要的一種，包括槲皮素、山奈酚和楊梅素均屬于黃酮醇，黃酮醇合成酶(蛋白點3)是黃酮醇合成途徑中的關(guān)鍵酶[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，干旱處理15天以后，杜仲葉片中的黃酮醇合成酶下調(diào)表達(dá)(表2)。結(jié)果表明，在缺水環(huán)境中的杜仲葉片中，黃酮醇類物質(zhì)合成受限。

3.2.4 干旱脅迫對杜仲葉片抗氧化保護(hù)酶的影響

活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)包含超氧化物陰離子自由基、羥基自由基、單線態(tài)氧、過氧化氫等，在逆境脅迫下，植物會產(chǎn)生過量的ROS，并引發(fā)氧化脅迫，攻擊細(xì)胞膜導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，并導(dǎo)致植物逆境脅迫損傷[22]，因此，干旱處理后的杜仲葉片丙二醛含量會上升(表1)。ROS也會攻擊蛋白質(zhì)使其降解，比如干旱脅迫后的杜仲葉片Rubisco(蛋白點6)被降解成小片段(蛋白點20與21)，從而抑制了杜仲葉片的光合作用(表1)。植物體一般會通過改變一些過氧化保護(hù)酶的表達(dá)量和活性，將過量ROS加以清除[22]，比如過氧化物酶a(蛋白點25)、L-抗壞血酸過氧化物酶(蛋白點27)、碳酸酐酶(蛋白點32)、胞質(zhì)抗壞血酸過氧化物酶1(蛋白點33)、2-Cys過氧化物氧化還原酶(蛋白點35)、[Cu-Zn]超氧化物歧化酶(蛋白點36)，這些蛋白質(zhì)在干旱處理的杜仲葉片中均上調(diào)表達(dá)(表2)。另一方面，生理指標(biāo)結(jié)果表明，杜仲葉片中SOD、POD和CAT的活性，在干旱處理后增強(qiáng)(表1)。結(jié)果表明，杜仲葉片可以通過增加過氧化保護(hù)酶的表達(dá)量和活性來抵御干旱。

3.2.5干旱脅迫對杜仲葉片氨基酸和蛋白生物合成的影響

提升植物細(xì)胞內(nèi)游離氨基酸含量是植物適應(yīng)逆境脅迫的一個重要機(jī)制，因為氨基酸可以作為一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，因此，氨基酸合成相關(guān)酶的調(diào)控對植物適應(yīng)干旱環(huán)境極其重要[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，在干旱處理15 d后的杜仲葉片中，氨基酸合成相關(guān)蛋白均上調(diào)表達(dá)(表2)，包括S-腺苷甲硫氨酸合成酶3(蛋白點11)、谷氨酰胺合成酶(蛋白點13)、甘氨酸脫氫酶(蛋白點27)。其中谷氨酰胺合成酶在氮代謝過程中起著關(guān)鍵作用，且與植物體內(nèi)脯氨酸水平調(diào)節(jié)緊密相關(guān)[14]，它在干旱脅迫下杜仲葉片中的上調(diào)表達(dá)，與杜仲葉片脯氨酸含量上升(表1)的結(jié)果一致。

本研究發(fā)現(xiàn)4個蛋白與蛋白質(zhì)代謝相關(guān)，包括核糖體蛋白L22(蛋白點1)、RNA聚合酶α鏈(蛋白點15)、胚胎發(fā)育晚期蛋白Dc3(LEA Dc3，蛋白點19)、RNA結(jié)合蛋白CP31B(蛋白點34)。根據(jù)這些蛋白的分子功能，可將其歸為兩類蛋白，即蛋白質(zhì)生物合成表達(dá)相關(guān)蛋白(蛋白點1、15和34)和分子伴侶蛋白(蛋白點19)，這兩類蛋白在干旱處理后的杜仲葉片中分別表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)和上調(diào)表達(dá)，表明干旱處理導(dǎo)致蛋白質(zhì)的生物合成受到抑制，但是仍需要發(fā)揮分子伴侶蛋白的功能，以維持某些蛋白質(zhì)的正常結(jié)構(gòu)，保持其活性。

4 結(jié)論

通過生理生化指標(biāo)分析和蛋白質(zhì)組學(xué)差異研究，杜仲可以通過提升信號傳導(dǎo)、碳水化合物代謝途徑、能量代謝、氨基酸合成和抗氧化相關(guān)蛋白的表達(dá)，同時增加脯氨酸含量、可溶性糖含量以及氧化保護(hù)酶活性，以增強(qiáng)杜仲的抗旱能力；另一方面，持續(xù)性干旱脅迫通過降低杜仲葉片光合作用、次級代謝物合成、蛋白質(zhì)的生物合成相關(guān)蛋白的表達(dá)，使這些生物學(xué)過程在干旱處理后受到限制。研究結(jié)果可為揭示杜仲響應(yīng)干旱脅迫的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

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