趙 敏 楊 寧 陳 璐 安炎黃 李文領(lǐng) 趙峰峰

(西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，蘭州 730070)

植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中經(jīng)常會(huì)遭受逆境環(huán)境的影響，干旱作為一種重要的環(huán)境因素一直是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[1]。植物體在干旱脅迫下水分代謝平衡失調(diào)，引起細(xì)胞失水，導(dǎo)致植物體外部形態(tài)和內(nèi)部生理生化特征發(fā)生顯著變化[2]。有研究表明[3]，干旱脅迫可導(dǎo)致植物產(chǎn)生包括滲透調(diào)節(jié)、傷害控制及修復(fù)等一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，通過(guò)感知脅迫信號(hào)、傳遞至細(xì)胞、激活級(jí)聯(lián)信號(hào)反應(yīng)、促使相關(guān)基因表達(dá)以及調(diào)節(jié)參與防御和適應(yīng)脅迫蛋白等過(guò)程從而適應(yīng)脅迫。從植物本身出發(fā)，深入了解植物細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子在生理和分子等水平響應(yīng)抗旱的特性、揭示其抗旱機(jī)理，將會(huì)為改善旱地生態(tài)和節(jié)水農(nóng)業(yè)的栽培問(wèn)題及選育抗旱品種提供一些理論依據(jù)。

磷脂酶是位于細(xì)胞膜上可以水解磷脂酰膽堿的一類酶。根據(jù)水解磷脂位置的不同，可劃分為磷脂酶D(phospholipase D，PLD)、磷脂酶C(phospholipase C，PLC)、磷脂酶A1(phospholipase A1，PLA1)和磷脂酶A2(phospholipase A2，PLA2)[4]，它們廣泛分布于植物的根、莖、葉、種子等組織中，且萌發(fā)初期的幼苗、生長(zhǎng)和代謝活躍的部位以及成熟初期的種子中含量更為豐富，并參與植物細(xì)胞中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和生理生化過(guò)程[5]。其中PLD是一個(gè)多基因家族的酶，己經(jīng)發(fā)現(xiàn)擬南芥存在12種不同的基因，這12種不同的PLD根據(jù)其序列相似性、蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、底物的親和性、調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域的不同可以劃分成6類：PLDα(3)，β(2)，γ(3)，δ，ε，ζ(2)[6～7]，PLDα有3條基因，PLDα1-3，其中PLDαl在已檢測(cè)的植物中普遍存在且豐度最高，特別是在植物受到逆境環(huán)境時(shí)發(fā)揮作用。Sang等[8]的實(shí)驗(yàn)證明，干旱脅迫下，野生型擬南芥抗旱性高于PLDα缺失型植株，而PLDα基因抑制型植株葉片的蒸騰失水率顯著高于野生型。PLDα1參與植物響應(yīng)干旱、高鹽和低溫等脅迫，以及ABA調(diào)節(jié)的氣孔運(yùn)動(dòng)[9]。PLD催化磷脂產(chǎn)生的磷脂酸(PA)作為第二信使在植物生長(zhǎng)發(fā)育和各種脅迫方面發(fā)揮重要作用，包括種子萌發(fā)和幼苗發(fā)育、根毛生長(zhǎng)和根的發(fā)育、氣孔運(yùn)動(dòng)、葉片衰老及果實(shí)成熟等各個(gè)階段的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程[10]。研究植物細(xì)胞中的PLD對(duì)于研究細(xì)胞膜的完整性、功能的穩(wěn)定性以及探究植物的耐受性而言具有重要的意義。

除一氧化氮(NO)、一氧化碳(CO)之外，H2S已經(jīng)被證明是第三種內(nèi)源性氣體信號(hào)分子[11]。在哺乳動(dòng)物中，它介導(dǎo)胰島素分泌、血管舒張、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激以及細(xì)胞周期等多方面的生理過(guò)程，是一個(gè)分布普遍、功能多樣的信號(hào)分子[12]。高等植物中NO和CO已經(jīng)被證明是重要的信號(hào)分子，與動(dòng)物中的功能有很多相似之處，相對(duì)而言，在植物體內(nèi)關(guān)于H2S的作用的研究較為緩慢。植物內(nèi)源H2S主要是以L-CDes)和D-CDes)催化分解L-半胱氨酸(L-Cys)和D-半胱氨酸(D-Cys)產(chǎn)生，LCD與DCD相比，LCD的催化活力更高[13]。早在40年前，就有在菜豆、玉米中檢測(cè)到內(nèi)源H2S釋放的相關(guān)報(bào)道[14]。之后H2S相關(guān)的研究，也僅僅局限于生理指標(biāo)的測(cè)定和一些現(xiàn)象的初步探討，未從“氣體信號(hào)分子”的研究方向去深入研究。近年有文獻(xiàn)報(bào)道了植物H2S信號(hào)參與非生物脅迫抗性[15]、抗氧化脅迫[16]、根形態(tài)建成和種子萌發(fā)[17]等方面的報(bào)道。

PLDα是擬南芥中含量最豐富的磷脂酶之一，也是細(xì)胞內(nèi)催化產(chǎn)生PA的關(guān)鍵酶[18～19]，在其生長(zhǎng)發(fā)育和逆境響應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。已有實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，滲透脅迫下，PLDα1可作用于一氧化氮合酶促進(jìn)一氧化氮釋放，從而響應(yīng)干旱脅迫[20]，相似地，同樣作為氣體信號(hào)分子的H2S是否也能通過(guò)PLDα1作用于L/D-DEs促進(jìn)H2S生成以響應(yīng)干旱脅迫；而且，氣體信號(hào)分子H2S和PLDα1都可以調(diào)節(jié)植物的種子萌發(fā)、逆境響應(yīng)、氣孔運(yùn)動(dòng)、根生長(zhǎng)等生理過(guò)程，但在干旱脅迫下H2S和PLDα1是如何響應(yīng)的，以及二者之間的可能存在的信號(hào)關(guān)系研究暫未見(jiàn)國(guó)內(nèi)外有報(bào)道。本研究中，我們選擇哥倫比亞野生型擬南芥WT、PLDα1和H2S合成酶缺失型突變體pldα1-1、lcd-4為材料，以0.3 mol·L-1甘露醇模擬干旱脅迫，結(jié)合外源添加PLD下游產(chǎn)物PA以及H2S供體NaHS，利用生理指標(biāo)結(jié)合分子手段的方法，探討了PLDα1與H2S在擬南芥耐旱性中作用及關(guān)系，希望能夠?yàn)榻沂綡2S、PLD響應(yīng)干旱的信號(hào)通路以及為植物旱地生態(tài)防御機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 擬南芥的培養(yǎng)

本試驗(yàn)以Col-0、pldα1-1(SALK_067533)和lcd-4(SALK_082099)突變體擬南芥為研究材料。其中，Col-0型種子由本課題組提供，pldα1-1和lcd-4 T-DNA插入突變體種子均購(gòu)自美國(guó)俄亥俄州立大學(xué)擬南芥生物資源中心(ABRC)。

將擬南芥種子用無(wú)菌水浸泡后，放置于4℃冰箱中春化3 d。將種子用無(wú)菌水沖洗30 s，75%乙醇吹打30 s，無(wú)菌水沖洗30 s，隨后用0.5%次氯酸鈉溶液清洗2 min，無(wú)菌水沖洗3次。接種于MS+30 g·L-1蔗糖、pH5.8的瓊脂培養(yǎng)基中，在溫度23℃、光照2 000 lux、光周期為16/8 h的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 d。土培苗按照土∶蛭石=2∶1的栽培方法，光周期為16/8 h，每周澆兩次營(yíng)養(yǎng)液，待生長(zhǎng)至5周進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理。

選擇生長(zhǎng)一致的擬南芥植株以0.3 mol·L-1的甘露醇進(jìn)行干旱處理，處理時(shí)間為：6、12、24、48、72 h。實(shí)驗(yàn)以0 h作為空白對(duì)照，未添加甘露醇處理的作為陰性對(duì)照組，添加甘露醇處理為實(shí)驗(yàn)組。

1.2 突變體鑒定

1.2.1 擬南芥總DNA提取

取生長(zhǎng)4周的擬南芥新鮮葉片，按照Easy Pure? Plant Genomic DNA Kit提取總DNA。

1.2.2 突變體鑒定引物

根據(jù)http://signal.salk.edu/tdnaprimers.2.html設(shè)計(jì)特異性引物。

表1鑒定突變體特異性引物

Table1IdentificationofmutantprimersforPCRinthemanuscription

引物名稱Primer name基因序列Gene sequenceLBa15'-TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG-3'AtPLDα1 LP5'-CCAAAAGAGTTGTCGCTGAAG-3'AtPLDα1 RP5'-CATTCTCTCACCACGTCATTG-3'Atlcd LP5'-GATTGAGGGATGGAGAGGAAG-3'Atlcd RP5'-AGTCGGAGTTTCTTACTCGCC-3'

1.2.3 PCR體系

PCR采用20 μL體系：1 μLpldα1、lcd上游引物，1 μL下游引物，WT、pldα1、lcdDNA模板1 μL，2×Taq PCR Star Mix with Loading Dye 10 μL，ddH2O 7 μL。PCR循環(huán)條件為：

pldα1程序設(shè)定為：94℃ 10 min，30個(gè)循環(huán)(94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s)，72℃ 1 min。

lcd程序設(shè)定為：94℃ 10 min，30個(gè)循環(huán)(94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 30 s)，72℃ 1 min。

采用1%的瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠(EB)染色，UVI凝膠圖像分析系統(tǒng)觀察照相。

1.3 擬南芥RNA提取

使用TaKaRa公司的Trizol試劑盒進(jìn)行提取，所有提取用品在121℃高壓滅菌25 min，試驗(yàn)過(guò)程均在超凈工作臺(tái)進(jìn)行，提取出的RNA用TaKaRa公司的PrimerScriptTMRT reagent Kit With gCDNA Eraser(Perfect Real Time)反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成為cDNA。

1.4 RT-qPCR反應(yīng)

RT-qPCR反應(yīng)體系：按照TAKARA公司的SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)操作說(shuō)明書(shū)于25 μL反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系如下：SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)12.5 μL，正反向引物各1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O加至25 μL，反應(yīng)在IQ5 Multicolor Real-time PCR Detection System中進(jìn)行。RT-qPCR反應(yīng)程序?yàn)椋篊ycle 1(1×)：95.0℃ 10 min；Cycle 2(40×)：95.0℃ 15 sec，60.0℃ 30 sec；Cycle3(81×)：72.0℃ 30 sec。至少進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。定量引物用DNAstar軟件PrimerSelect模塊，設(shè)計(jì)特異性引物。

表2基因特異性引物

Table2ListofallgenesforRT-PCRinthemanuscript

引物名稱Primer name基因序列Gene sequenceActin LP5'-TGTGCCAATCTACGAGGGTTT-3'Actin RP5'-TTTCCCGCTCTGCTGTTGT-3'AtPLDα1 LP5'-CACTCCGTTCCACTCCTTGTTCA-3'AtPLDα1 RP5'-CCACCCTGCTTGCTCCATCTCT-3'AtLCD LP5'-TGTATGTGAGGAGGAGGC-3'AtLCD RP5'-GTTTCATACTGATGCTGCTC-3'AtDCD LP5'-CATGCCATGGCAATGAGAGGACGAAGCTTGACACTCTC-3'AtDCD RP5'-CGGGATCCCTAGAACATTTTCCCAACACCATCTT-3'

1.5 PLD、L/D-DEs酶活以及H2S含量測(cè)定

PLD酶活性、H2S含量由上海酶聯(lián)生物公司的試劑盒測(cè)定，L/D-DEs酶活性測(cè)定采用亞甲基藍(lán)法[21]，略有改動(dòng)。具體方法如下：稱取不同處理的擬南芥蓮座葉0.2 g，加入2 mL 20 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液研磨(pH7.4)，離心后取上清。1 mL的反應(yīng)體系為：0.8 mmmol·L-1L/D-Cys，2.5 mmmol·L-1DTT，100 mmmol·L-1Tris-HCl pH9.0/pH8.0和100 μL上清液，在37℃孵育15 min后，加入30 mmmol·L-1FeCl3與20 mmmol·L-1N,N-二甲基對(duì)苯二胺各100 μL終止反應(yīng)。室溫避光反應(yīng)15 min后，670 nm測(cè)定OD值。代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算L/D-DEs酶活性。

1.6 種子萌發(fā)率測(cè)定

選擇均勻飽滿的種子，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)有50顆種子，從開(kāi)始光照培養(yǎng)時(shí)起，觀察并統(tǒng)計(jì)萌發(fā)的種子數(shù)目，以胚根突破種皮1 mm即視為萌發(fā)，計(jì)算萌發(fā)百分率。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0對(duì)組間隨時(shí)間變化的差異性多重比較采用LSD法分析，作圖在Orgin pro 9.0中進(jìn)行。每次試驗(yàn)至少進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 pldα1與lcd純合突變體的篩選

以WT為對(duì)照，通過(guò)3引物法對(duì)突變體進(jìn)行鑒定，純合突變體中用基因特異性引物無(wú)法擴(kuò)增出條帶，用T-DNA特異性引物可以擴(kuò)增出目的帶，結(jié)果如圖1所示，從而篩選出lcd與pldα1純合突變體，擴(kuò)繁并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 lcd、pldα1純合突變體的篩選 1.WT(LP+RP)；2.lcd(LP+RP)；3.lcd(LB+RP)；4.WT(LP+RP)；5.pldα1(LP+RP)；6.pldα1(LB+RP)Fig.1 Identification of pldα1 and lcd homozygous strains 1.WT(LP+RP)；2.lcd(LP+RP)；3.lcd(LB+RP)；4.WT(LP+RP)；5.pldα1(LP+RP)；6.pldα1(LB+RP)

2.2 干旱脅迫對(duì)擬南芥生長(zhǎng)的影響

由圖2可知，萌發(fā)10 d后，野生型擬南芥WT、pldα1、lcd突變體積極響應(yīng)干旱脅迫，其生長(zhǎng)明顯受到抑制，而且干旱對(duì)種子萌發(fā)也有一定的抑制作用。

圖2 干旱脅迫對(duì)WT、pldα1、lcd擬南芥生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effects of drought stress on the growth of WT,pldα1 and lcd Arabidopsis thaliana

2.3 干旱脅迫對(duì)野生型擬南芥PLD、H2S含量及L/D-DEs酶活性的影響

干旱脅迫下PLD活性隨處理時(shí)間的變化如圖3A所示，從圖中可以看出，在不同的干旱脅迫時(shí)間下，PLD活性均顯著高于空白對(duì)照組。與對(duì)照組相比，0.3 mol·L-1甘露醇處理6～72 h，PLD活性分別在24 h最低，48 h達(dá)到最大值。

由圖3B可知，干旱脅迫可誘導(dǎo)野生型擬南芥葉片H2S含量的增加，同時(shí)顯著提高了擬南芥葉片中L/D-CDes活性(圖3:C～D)，且酶活性的變化與H2S水平的變化趨勢(shì)相一致，均高于對(duì)照組。其中干旱脅迫下H2S含量較對(duì)照組隨時(shí)間變化顯著升高，且H2S含量、L/D-CDes活性在脅迫72 h后達(dá)到最大值，較對(duì)照增高55.49%。由此得出H2S響應(yīng)干旱脅迫，且L/D-CDes與干旱誘導(dǎo)的H2S合成密切相關(guān)。

圖4表明，PLDα1和LCD基因的缺失會(huì)顯著影響擬南芥中H2S的產(chǎn)生，與對(duì)照組WT相比，pldα1和lcd擬南芥突變體中H2S含量顯著下降，pldα1和lcd擬南芥突變體中H2S含量分別下降17.42%和72.49%，H2S產(chǎn)生量WT>pldα1>lcd，表明干旱誘導(dǎo)了H2S的合成，PLDα1和LCD均參與了H2S合成途徑。與空白對(duì)照組相比，在干旱脅迫條件下，3種擬南芥的H2S含量均顯著上升。

圖3 干旱脅迫對(duì)野生型擬南芥PLD活性(A)、H2S含量(B)、L-Des(C)以及D-Des(D)活性的影響 圖中小寫(xiě)字母表示同一時(shí)間不同濃度在P<0.05時(shí)的顯著性差異；大寫(xiě)字母表示不同時(shí)間同一濃度在P<0.05時(shí)的顯著性差異 下同。Fig.3 Effects of PLD activity(A), H2S content(B), L-DEs(C) and D-DEs(D) activity in Col-0 type Arabidopsis on drought stress The lower case letters indicate the same time different concentrations at P<0.05 when the significant difference between the capital letters that the same concentrations at the different time in the P<0.05 significant difference The same as below.

圖4 干旱脅迫對(duì)WT、pldα1和lcd中H2S產(chǎn)生的影響Fig.4 Effects of H2S production in WT,pldα1 and lcd on drought stress

圖5 干旱脅迫對(duì)LCD(A)、DCD(B)和PLDα1(C)基因相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.5 Relative expression of LCD(A),DCD(B) and PLDα1(C) on drought stress

2.4 干旱脅迫對(duì)擬南芥LCD、DCD和PLDα1基因相對(duì)表達(dá)量的影響

圖5A表明，LCD基因相對(duì)表達(dá)量隨干旱脅迫時(shí)間的變化情況。在所研究的干旱處理時(shí)間范圍內(nèi)，LCD基因相對(duì)表達(dá)量總體表現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，但在48 h處略有下降，但仍顯著高于陰性對(duì)照組，變化趨勢(shì)與L-DEs酶活性基本保持一致。LCD基因表達(dá)在脅迫72 h時(shí)達(dá)到最大值。圖5B中，在6～24 hDCD相對(duì)表達(dá)量隨干旱脅迫時(shí)間呈增加趨勢(shì)，在24 h時(shí)達(dá)到最大值。圖5C表示PLDα1基因相對(duì)表達(dá)量隨干旱脅迫時(shí)間的變化情況，PLDα1基因在6～72 h相對(duì)表達(dá)量隨干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)進(jìn)一步增加，呈現(xiàn)波動(dòng)趨勢(shì)，分別在6 h達(dá)到最小和在48 h最大值。轉(zhuǎn)錄水平分析表明，干旱脅迫可能通過(guò)誘導(dǎo)LCD、DCD與PLDα1基因的表達(dá)，促進(jìn)L/D-CDes、PLD酶活性升高，從而增加擬南芥內(nèi)源H2S的釋放。

2.5 干旱脅迫下，外源添加PA、NaHS對(duì)擬南芥中H2S含量的影響

當(dāng)PLDα1，LCD缺失后造成其下游產(chǎn)物的減少，因此通過(guò)外源添加PLD下游產(chǎn)物PA以及H2S供體NaHS從而來(lái)補(bǔ)償PLDα1和LCD的缺失。

如圖6所示，干旱脅迫下，外源添加80 μmol·L-1PA，150 μmol·L-1NaHS后，隨著處理時(shí)間，H2S含量會(huì)顯著上升。說(shuō)明，PLD下游產(chǎn)物PA和H2S供體NaHS顯著影響野生型擬南芥H2S產(chǎn)生。

圖6 干旱脅迫下，外源添加PA、NaHS對(duì)WT中H2S含量的影響Fig.6 Effects of exogenous PA and NaHS on H2S content on drought stress

2.6 干旱脅迫對(duì)pldα1和lcd擬南芥種子萌發(fā)率及H2S含量的影響

萌發(fā)實(shí)驗(yàn)中，0.3 mol·L-1甘露醇處理2 d后，WT和pldα1、lcd突變體的種子萌發(fā)發(fā)生顯著改變，隨著干旱處理時(shí)間的延長(zhǎng)pldα1和lcd種子萌發(fā)率始終低于WT，且干旱脅迫對(duì)lcd種子萌發(fā)的抑制作用更加顯著(圖7)。進(jìn)一步說(shuō)明PLDα1和LCD基因參與調(diào)控種子萌發(fā)。

圖7 干旱脅迫對(duì)WT、pldα1和lcd萌發(fā)率的影響Fig.7 Effects of germination rate of WT,pldα1 and lcd under drought stress

圖8 干旱脅迫下，外源添加PA或NaHS對(duì)WT、pldα1和lcd萌發(fā)率(A)及H2S含量(B)的影響Fig.8 Effects of exogenous PA or NaHS on the germination rate(A) and H2S content(B) of WT,pldα1 and lcd under drought stress

如圖8A所示，0.3 mol·L-1甘露醇的處理顯著抑制了擬南芥種子的萌發(fā)率，150 μmol NaHS可以促進(jìn)干旱脅迫下WT、pldα1和lcd的種子萌發(fā)，且對(duì)lcd作用最為明顯；80 μmol PA可以促進(jìn)干旱脅迫下WT和pldα1的種子萌發(fā)，但對(duì)lcd的種子萌發(fā)率沒(méi)有顯著的影響。說(shuō)明H2S位于PA的下游。外源添加NaHS或PA后，pldα1和lcd均沒(méi)有恢復(fù)到WT的萌發(fā)水平，說(shuō)明調(diào)控種子萌發(fā)過(guò)程的不只是PLDα1和LCD參與。圖8B進(jìn)一步說(shuō)明了干旱脅迫能誘導(dǎo)WT、pldα1和lcd擬南芥內(nèi)源H2S的釋放，且外施NaHS可以促進(jìn)干旱脅迫下pldα1和lcd中的H2S產(chǎn)生，PA促進(jìn)干旱脅迫下pldα1的H2S的含量，但對(duì)lcd中H2S的產(chǎn)生促進(jìn)作用不明顯，證實(shí)了H2S位于PA的下游。

3 討論

干旱對(duì)植物生長(zhǎng)的各個(gè)時(shí)期都會(huì)產(chǎn)生脅迫影響，通過(guò)對(duì)植物干旱條件下抗旱機(jī)制的研究，可減少全球變暖日益嚴(yán)峻的大環(huán)境下造成的區(qū)域性干旱威脅，是緩解干旱造成的作物減產(chǎn)、維持干旱地區(qū)生態(tài)等的重要途徑之一。植物中，PLD是一類磷脂水解酶，不僅能催化磷脂的水解，而且在維持膜結(jié)構(gòu)和功能方面具有重要的重要[22]。有關(guān)研究表明，植物受到脅迫時(shí)會(huì)激活PLD，它是引起植物系統(tǒng)磷脂降解反應(yīng)的初始酶類[23]。磷脂酶是調(diào)控細(xì)胞磷脂代謝的關(guān)鍵酶，磷脂酶的活動(dòng)與功能對(duì)植物細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程起著非常重要的作用。擬南芥細(xì)胞膜在各種脅迫條件下受損，這就被作為評(píng)價(jià)膜傷害的指標(biāo)之一。在干旱脅迫下對(duì)PLDα1的研究主要集中在ABA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉過(guò)程中[24]，對(duì)其在干旱脅迫下的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用研究相對(duì)較少。植物內(nèi)源H2S主要以L-半胱氨酸(L-Cys)為底物，通過(guò)半胱氨酸脫巰基酶(CDes)的作用產(chǎn)生。目前擬南芥中已經(jīng)克隆了一些CDes編碼基因。第一個(gè)報(bào)道的是以L-Cys為底物的L-cysteine desulphydrase(LCD)編碼基因(At3962130)，另一個(gè)是以D-Cys為底物的稱為D-cysteine desulphydrase(DCD)編碼基因(At1g48420)[25]。目前，LCD和DCD是植物內(nèi)源H2S產(chǎn)生過(guò)程中功能最明確的兩個(gè)CDes酶。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,H2S能夠作為一種信號(hào)分子參與動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)以及心腦血管系統(tǒng)的生長(zhǎng)發(fā)育[26]，但H2S在植物中的具體作用及其機(jī)制研究尚不清楚。H2S是涉及植物生長(zhǎng)發(fā)育和生物及非生物脅迫應(yīng)答中重要的氣體信號(hào)分子[27]，且NaHS被常用于植物H2S供體研究。已有研究證明，外源H2S能夠促進(jìn)小麥種子萌發(fā)，并可以通過(guò)調(diào)節(jié)活性氧代謝減緩銅離子脅迫所引起的氧化損傷[28]。最近的研究表明滲透脅迫調(diào)節(jié)H2S合成的表達(dá)水平，進(jìn)一步增強(qiáng)了L/D-DEs酶活性，導(dǎo)致產(chǎn)生更多H2S和提高植物耐受性[29]。已知PLDα1與H2S都會(huì)在逆境環(huán)境下做出響應(yīng)，那么PLDα1、H2S是否參與植物對(duì)干旱應(yīng)答的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程？如果參與了，它們?cè)诟珊得{迫過(guò)程中又扮演著什么樣的角色呢？

本研究發(fā)現(xiàn)，以0.3 mol·L-1甘露醇進(jìn)行干旱處理，PLDα1基因與PLD活性對(duì)干旱脅迫做出積極的響應(yīng)，變化趨勢(shì)先升高后下降再升高(圖3A)。這與何文平等[30]研究低溫脅迫對(duì)高山離子芥PLD活性影響趨勢(shì)一致。可能是由于在脅迫早期，PLD響應(yīng)干旱脅迫而被激活，因而PLD活性上升，脅迫一定時(shí)間后，植物可能對(duì)脅迫產(chǎn)生了一定程度的適應(yīng)，PLD活性隨之下降，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞膜受到損害，PLD活性再次上升。

另外，本研究發(fā)現(xiàn)，0.3 mol·L-1甘露醇處理能夠引起擬南芥葉片中H2S含量(圖3B)、LCD和DCD基因表達(dá)量(圖5:A～B)、L/D-CDes酶活性升高(圖3:C～D)。表明H2S參與了擬南芥響應(yīng)的干旱脅迫，并且H2S含量的上升與L-DEs及D-DEs活性的增高有關(guān)，其中L-DEs的活性明顯高于D-DEs，說(shuō)明L-DEs是干旱脅迫下H2S產(chǎn)生的主要途徑。LCD和DCD兩個(gè)基因表達(dá)量與L/D-DEs活性在干旱脅迫下的上升趨勢(shì)基本相同，其中LCD的表達(dá)量顯著高于DCD的表達(dá)量，與其酶活變化一致，說(shuō)明干旱脅迫下L/D-DEs活性的上升與LCD和DCD兩個(gè)基因的表達(dá)有關(guān)，且LCD發(fā)揮著更為重要的作用。

利用WT、pldα1以及l(fā)cd檢測(cè)內(nèi)源H2S含量，研究干旱脅迫下PLDα1、LCD與H2S合成的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，pldα1、lcd與WT相比，H2S含量明顯下降(圖4)，且LCD缺失后，H2S含量下降較為明顯，說(shuō)明PLDα1、LCD可參與H2S的合成過(guò)程。PLDα1、LCD缺失后，最直接的效應(yīng)是產(chǎn)物減少，因此我們向培養(yǎng)基中添加PLD的下游產(chǎn)物PA和H2S供體NaHS，進(jìn)行補(bǔ)償實(shí)驗(yàn)。干旱脅迫下，WT中通過(guò)外源添加80 μmol·L-1PA，150 μmol·L-1NaHS，在不同處理時(shí)間下，都會(huì)促進(jìn)H2S的產(chǎn)生，說(shuō)明PA以及NaHS參與干旱脅迫下H2S合成，暗示著PLD與H2S之間有一定的聯(lián)系(圖6)。

萌發(fā)率實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，干旱脅迫明顯抑制擬南芥種子萌發(fā)。如圖7所示，我們發(fā)現(xiàn)pldα1與lcd兩個(gè)突變體植株對(duì)干旱脅迫更加敏感，且種子萌發(fā)較WT相比延遲萌發(fā)，隨后的幾天萌發(fā)率緩慢增加，但差異一直存在，pldα1和lcd種子萌發(fā)率始終低于WT，且干旱脅迫對(duì)lcd種子萌發(fā)抑制作用更顯著，說(shuō)明PLDα1、LCD基因參與種子萌發(fā)過(guò)程。之前的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)驗(yàn)證PLDα1、LCD缺失會(huì)影響H2S的合成，且外源PA、NaHS參與干旱脅迫下H2S產(chǎn)生過(guò)程。那么PLDα1和LCD究竟在發(fā)揮怎樣的作用？我們利用WT、pldα1和lcd，通過(guò)外源添加PA以及NaHS進(jìn)行補(bǔ)償實(shí)驗(yàn)，如圖8A，結(jié)果表明，WT與pldα1中80 μmol·L-1PA和150 μmol·L-1NaHS處理均可以不同程度的促進(jìn)干旱脅迫下種子的萌發(fā)，且外源PA的作用更為顯著，lcd中外源添加150 μmol·L-1NaHS可以顯著的緩解干旱脅迫對(duì)lcd萌發(fā)的抑制，但是外源PA處理卻對(duì)它沒(méi)有顯著影響，推測(cè)干旱脅迫下，H2S信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)可能位于PA下游。為了驗(yàn)證這一結(jié)論，進(jìn)一步研究了PA和NaHS對(duì)WT、pldα1以及l(fā)cd中H2S含量的影響，發(fā)現(xiàn)PA能促進(jìn)WT和pldα1中H2S的生成，但對(duì)lcd中的H2S的產(chǎn)生沒(méi)有顯著的促進(jìn)作用(圖8B)。在分別補(bǔ)償NaHS和PA后，pldα1和lcd并沒(méi)有恢復(fù)到WT的萌發(fā)水平及H2S產(chǎn)生量，說(shuō)明調(diào)控種子萌發(fā)及H2S產(chǎn)生不僅僅是通過(guò)L-CDes和PLDα1途徑，還可能存在其它調(diào)控途徑。以上結(jié)果表明，PLDα1的產(chǎn)物PA主要通過(guò)L-CDes來(lái)促進(jìn)H2S的產(chǎn)生進(jìn)而促進(jìn)干旱脅迫下擬南芥的種子萌發(fā)，干旱脅迫下H2S信號(hào)在PA的下游起作用。

綜上所述，信號(hào)分子H2S、L/D-DEs和PLD對(duì)干旱脅迫均能做出響應(yīng)，PLD、L/D-Des活性變化與PLDα1、LCD和DCD基因的表達(dá)有關(guān)；L-CDes是干旱脅迫下H2S的主要產(chǎn)生途徑，干旱脅迫下H2S信號(hào)可能位于PLDα1信號(hào)的下游發(fā)揮作用?？赡艿淖饔脵C(jī)制為：干旱脅迫下PLDα1的下游產(chǎn)物PA通過(guò)促進(jìn)L-CDes的活性進(jìn)而促進(jìn)H2S的釋放來(lái)影響擬南芥的種子萌發(fā)。后期將對(duì)信號(hào)分子H2S、PLDα1以及L/D-CDes等在干旱脅迫下的作用機(jī)制繼續(xù)進(jìn)行深入研究，以期為干旱地區(qū)的作物生產(chǎn)、抗旱品種的篩選以及旱地生態(tài)環(huán)境的改善提供一定的理論依據(jù)。

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