王婧帆，季然，李鑫宇，陳金鈴(南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，江蘇南通226000)

Smad同源蛋白在將轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)信號從細(xì)胞表面受體傳導(dǎo)至細(xì)胞核的過程中起關(guān)鍵作用，且不同的Smad蛋白介導(dǎo)不同家族成員的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[1]。TGF-β1通過與絲氨酸/蘇氨酸激酶受體結(jié)合，誘導(dǎo)Smad2和Smad3磷酸化，磷酸化的Smad2、Smad3與Smad4形成蛋白復(fù)合物，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄[2]。TGF-β1能通過誘導(dǎo)Smad蛋白調(diào)節(jié)叉頭/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子3(Foxp3)的表達(dá)，因此TGF-β/Smad信號通路與Foxp3的表達(dá)密切相關(guān)。Foxp3是調(diào)控調(diào)節(jié)性T細(xì)胞發(fā)育及功能的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子[3]。Foxp3依靠其叉頭樣結(jié)構(gòu)和DNA結(jié)合，并停留在細(xì)胞核內(nèi)[4]。由于Foxp3的DNA結(jié)合域靠近蛋白C端，能抑制基因轉(zhuǎn)錄。因此，F(xiàn)oxp3能不同程度減少白細(xì)胞介素2(IL-2)、IL-4等細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄活性[5]。Foxp3基因突變可引起scurfy(sf)突變小鼠中X-連鎖的淋巴細(xì)胞增生性疾病，而在人類中的突變可導(dǎo)致調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的缺陷，導(dǎo)致免疫調(diào)節(jié)失調(diào)-多(種)內(nèi)分泌病-腸病-X-連鎖綜合征[6]。Smad蛋白尤其是Smad3蛋白，作為TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)器，參與調(diào)節(jié)TGF-β的活性[5]。有研究結(jié)果顯示，Smad3缺失導(dǎo)致Smad3-/-小鼠炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，同時伴有Th2和Th17型免疫應(yīng)答減弱，小鼠淋巴結(jié)中Foxp3的mRNA表達(dá)下調(diào)[6]。Tardif等[7]觀察到Foxp3增強(qiáng)子與轉(zhuǎn)錄因子Smad3、活化T細(xì)胞核因子(NFAT)結(jié)合，提示TGF-β可能通過此位點實現(xiàn)對Foxp3的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。2016年4月～2018年3月，本研究構(gòu)建并鑒定pcDNA3.1-Smad2、pcDNA3.1-Smad3和pcDNA3.1-Smad4真核表達(dá)質(zhì)粒，探討Smad真核表達(dá)質(zhì)粒在小鼠T淋巴瘤細(xì)胞(EL4)中是否能穩(wěn)定表達(dá)，為進(jìn)一步探究Smad蛋白調(diào)控Foxp3表達(dá)的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器 EL4細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫；Smad2購自Santa Cruz Biotechnology；Smad3、Smad4購自Cell Signaling Technology；大腸桿菌DH5α、pcDNA3.1真核表達(dá)載體、pMD19-T載體、T4連接酶、DNA聚合酶、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒及DNA marker均購自大連TaKaRa公司；Hind Ⅲ、EcoR Ⅰ及Xho Ⅰ等限制性內(nèi)切酶均購自中國Fermentas公司；電轉(zhuǎn)液購自北京Engreen Biosystem公司；電擊杯購自美國BTX公司。

1.2 Smad2、Smad3、Smad4基因擴(kuò)增與克隆 采用PCR技術(shù)。根據(jù)GenBank的Smad2、Smad3、Smad4基因組序列，分別設(shè)計相應(yīng)的特異性引物，擴(kuò)增Smad2、Smad3、Smad4基因。Smad2上游引物：5′-AAGCTTGCCACCATGTCGTCCATCTTGCCATTC-3′，下游引物：5′-GAATTCTTTGCTCTGGAATTTTTGGATAG-3′；Smad3上游引物：5′-GAATTCGCCACCATGTCGTCCATCCTGCCCTTC-3′，下游引物：5′-CTCGAGCCTGGGGTTTTCTTCTGTGGTC-3′；Smad4上游引物：5′-GAATTCGCCACCATGGACAATATGTCTAT-AACAAATACAC-3′，下游引物：5′-CTCGAGTCAGTCTAAAGGCTGTGGGTC-3′。以EL4細(xì)胞獲得的cDNA為模板，通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增出目的基因Smad2、Smad3、Smad4。PCR反應(yīng)總體系為50 μL，引物各1.5 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min，98 ℃變性10 s，60 ℃復(fù)性30 s，68 ℃延伸1 min，循環(huán)25次后68 ℃延伸30 min。PCR產(chǎn)物加“A”尾反應(yīng)，72 ℃反應(yīng)30 min，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定產(chǎn)物，目的片段按照DNA膠回收試劑盒說明書切膠回收。

1.3 pMD19-T載體構(gòu)建 制備DH5α感受態(tài)，PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體經(jīng)T4 DNA連接酶連接過夜。反應(yīng)體系總體積為10 μL，其中目的片段4 μL，pMD19-T 1 μL，Solution Ⅰ 5 μL。第2天取連接產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，于37 ℃倒置培養(yǎng)過夜，挑取單克隆菌落至LB液體培養(yǎng)基，37 ℃搖菌過夜，進(jìn)行菌液PCR。挑選PCR結(jié)果陽性的菌液抽提質(zhì)粒DNA進(jìn)行鑒定。重組質(zhì)粒置37 ℃水浴2 h，分別進(jìn)行單酶切和雙酶切驗證。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，驗證正確后，送由上海生工生物工程股份有限公司測序并通過DNAMAN軟件分析測序結(jié)果。

1.4 表達(dá)載體pcDNA3.1的構(gòu)建 將pMD19-T重組質(zhì)粒和pcDNA3.1質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ和EcoR Ⅰ/Xho Ⅰ進(jìn)行雙酶切，置于37 ℃水浴2 h，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收。純化獲得的酶切后的目的片段和pcDNA3.1載體通過T4連接酶連接，16 ℃反應(yīng)過夜，反應(yīng)體系：pcDNA3.1 1 μL，目的片段6 μL，5×T4 DNA ligase buffer 2 μL，T4 DNA ligase 1 μL。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，PCR鑒定為陽性的克隆通過雙酶切進(jìn)行驗證后，由上海生工生物工程股份有限公司測序并通過DNAMAN軟件分析測序結(jié)果。

1.5 轉(zhuǎn)染 將EL4細(xì)胞調(diào)整至5×106/mL，加入2 μg構(gòu)建好的pcDNA3.1-Smad2、pcDNA3.1-Smad3、pcDNA3.1-Smad4過表達(dá)質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)液(100 μL)吹打混勻，電轉(zhuǎn)儀電轉(zhuǎn)后置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。

1.6 EL4細(xì)胞中Smad2、Smad3及Smad4蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法。轉(zhuǎn)染后72 h，收集EL4細(xì)胞置EP管中，離心棄上清，PBS重懸細(xì)胞，離心棄上清。加入蛋白裂解液100 μL，冰上裂解20 min。細(xì)胞經(jīng)超聲破碎后，離心收集上清，檢測蛋白濃度。加入5×上樣緩沖液，沸水中煮沸10 min，置于-20 ℃冰箱備用。配制10%的分離膠，行電泳。轉(zhuǎn)膜后用10%脫脂牛奶封閉PVDF膜，室溫2 h。Smad2按1∶200稀釋，Smad3、Smad4 按1∶1 000稀釋，4 ℃孵育過夜。二抗1：5 000稀釋，室溫孵育1 h。TBST充分洗膜后，ECL顯影。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-Smad2、pcDNA3.1-Smad3、pcDNA3.1-Smad4鑒定結(jié)果 圖1A顯示，4號泳道上可見兩條清晰的條帶，其中一條與pcDNA3.1空載體(5 428 bp)的大小一致，另一條帶與第5泳道的PCR產(chǎn)物(Smad2)大小一致，提示pcDNA3.1-Smad2重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。圖1B顯示，4號泳道上可見兩條清晰的條帶，其中一條帶與pcDNA3.1空載體(5 428 bp)的大小一致，另一條帶與第5泳道的PCR產(chǎn)物(Smad3)大小一致，提示pcDNA3.1-Smad3重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。圖1C顯示，4號泳道上可見兩條清晰的條帶，其中一條條帶的大小與PCR產(chǎn)物(Smad4)的大小一致，提示pcDNA3.1-Smad4重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。測序結(jié)果證實插入的Smad2、Smad3、Smad4無突變。

注：M1為λ-Hind Ⅲ digest DNA Marker；1為pcDNA3.1質(zhì)粒；2為pcDNA3.1-Smad重組質(zhì)粒；3為pcDNA3.1-Smad重組質(zhì)粒經(jīng)EcoR Ⅰ單酶切產(chǎn)物；4為pcDNA3.1-Smad重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物；5為菌液PCR產(chǎn)物；M2為DL2000 DNA Marker。

圖1Smad真核表達(dá)質(zhì)粒鑒定結(jié)果

2.2 EL4細(xì)胞中Smad2、Smad3及Smad4蛋白表達(dá)變化 將構(gòu)建成功的pcDNA3.1-Smad2、pcDNA3.1-Smad3、pcDNA3.1-Smad4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至EL4細(xì)胞72 h后，EL4細(xì)胞中Smad2、Smad3、Smad4蛋白表達(dá)上調(diào)。見圖2。

注：A為Smad2蛋白表達(dá)；B為Smad3蛋白表達(dá)；C為Smad4蛋白表達(dá)。

圖2EL4細(xì)胞中Smad2、Smad3及Smad4蛋白表達(dá)

3 討論

Smad蛋白最早從果蠅及線蟲基因篩查中鑒定出來[8,9]，是TGF-β家族受體下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。根據(jù)Smad蛋白在TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的功能差異，分為受體調(diào)控Smad(R-Smad1/2/3/5/6)、通用Smad(Co-Smad4)及抑制型Smad(I-Smad6/7)。R-Smad能夠與受體結(jié)合并被受體磷酸化而激活；Co-Smad能夠與活化的R-Smad結(jié)合形成復(fù)合物，復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核結(jié)合DNA，與多種轉(zhuǎn)錄輔因子相互作用共同調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄；I-Smad 作為R-Smad的競爭性抑制子，能負(fù)性調(diào)控TGF-β信號通路。經(jīng)典的Smad信號通路通過TGF-β與絲氨酸/蘇氨酸激酶Ⅰ型和Ⅱ型受體結(jié)合發(fā)揮效應(yīng)。Ⅰ型受體激酶上游存在一個富含甘氨酸/絲氨酸的G 序列，TGF-β與Ⅱ型受體結(jié)合從而磷酸化Ⅰ型受體GS區(qū)，GS區(qū)的磷酸化隨之活化Ⅰ型受體，活化的Ⅰ型受體繼而磷酸化R-Smad C末端的SXS基序中的絲氨酸。活化的R-Smad與Smad4形成蛋白復(fù)合物，隨后轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)，與不同的Smad結(jié)合原件、DNA轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄共激活劑或共抑制劑結(jié)合，從而實現(xiàn)對靶基因的調(diào)控[10]。

Foxp3是調(diào)控調(diào)節(jié)性T細(xì)胞發(fā)育及功能的關(guān)鍵性的轉(zhuǎn)錄因子。TGF-β1通過誘導(dǎo)Smad蛋白調(diào)節(jié)Foxp3的表達(dá)[11]。有研究證實，TGF-β誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子Smad3和NFAT協(xié)同作用，與Foxp3內(nèi)含子中的增強(qiáng)子元件相結(jié)合實現(xiàn)對Foxp3的調(diào)控。Smad3是TGF-β1信號通路的近端分子，在Foxp3的表達(dá)中起主要作用。在野生型小鼠中TGF-β1是T細(xì)胞表達(dá)Foxp3的一個有效的誘導(dǎo)劑；在Smad3敲除小鼠中，F(xiàn)oxp3+T細(xì)胞明顯減少[12]。因此，Smad3在TGF-β1誘導(dǎo)的Foxp3的產(chǎn)生過程中起重要的調(diào)節(jié)作用[13]。在之前的研究中，Smad3和Smad4已被證實能調(diào)節(jié)由TGF-β誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，但在Th17細(xì)胞的產(chǎn)生中作用不大[7]。當(dāng)Smad2缺失時，TGF-β誘導(dǎo)的Foxp3的表達(dá)會急劇減少。小鼠脾細(xì)胞經(jīng)細(xì)粒棘球蚴囊液處理后，細(xì)粒棘球蚴囊液能上調(diào)對小鼠脾臟細(xì)胞中Treg相對特異分子Foxp3的表達(dá)，而下調(diào)TGF-β1的下游信號通路Smad4的表達(dá)，兩者之間呈負(fù)相關(guān)[14]。外周血中，Smad7和Foxp3水平能提示慢性移植腎腎病的發(fā)展程度，是檢測慢性移植腎腎病的一個無創(chuàng)指標(biāo)。Smad7可能通過某種機(jī)制調(diào)控Foxp3的表達(dá)。

本研究將提取的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-Smad2、pcDNA3.1-Smad3及pcDNA3.1-Smad4分別用限制性內(nèi)切酶雙酶切后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后可見2條清晰條帶，一條與目的片段的大小一致，另一條與pcDNA3.1空載體的大小一致，提示構(gòu)建的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-Smad2、pcDNA3.1-Smad3、pcDNA3.1-Smad4中有目的片段插入。DNA測序及比對結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pcDNA3.1-Smad2，pcDNA3.1-Smad3和pcDNA3.1-Smad4中的插入片段序列與目的基因的CDS區(qū)序列完全相同，進(jìn)一步說明成功構(gòu)建Smad2、Smad3、Smad4高表達(dá)載體。且將Smad真核表達(dá)質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染入EL4細(xì)胞后，能誘導(dǎo)目的蛋白高表達(dá)。本研究為進(jìn)一步探究Smad蛋白調(diào)控Foxp3表達(dá)的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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