劉世軍，王 林，唐志書*，宋忠興，崔春利，劉紅波，梁艷妮，張 娛，許洪波，史鑫波，雷甜甜

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)/陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 咸陽 712083；2.陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點實驗室，陜西 咸陽 712083；3.陜西省風(fēng)濕與腫瘤類中藥制劑工程技術(shù)研究中心，陜西 咸陽 712083）

大棗是鼠李科灌木植物棗（Ziziphus jujuba Mill.）的干燥成熟果實。大棗甘、溫。歸脾、胃經(jīng)，具有補中益氣、養(yǎng)血安神的功效[1]。十棗湯用大棗10枚煎湯送服，取其益脾緩中，防止逐水傷及脾胃，并緩和諸藥毒性[2-3]。小建中湯用大棗補脾而緩急止痛[4]。《本草綱目》記載將其作為丸劑的輔料使用[5]，張仲景的一些方劑[6]以及現(xiàn)在治療失眠的許多處方都有大棗[7-9]。大棗中含有豐富的環(huán)磷酸腺苷[10]。環(huán)磷酸腺苷為參與調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的第二信使物質(zhì)，其作用非常廣泛。經(jīng)常食用大棗可以增加人體白血球內(nèi)環(huán)磷酸腺苷的作用，具有良好的鎮(zhèn)靜、催眠和降壓的作用[11]，還能有效減輕化學(xué)藥物在人體的堆積對肝臟的損傷；可以增加人體免疫細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷的含量，從而抑制人體在受到外界刺激時所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)，降低過敏反應(yīng)的發(fā)生[12]。本實驗通過醋炙、酒炙、醋蒸、酒蒸、三蒸三制、炒焦等炮制方法對大棗進行炮制后，采用高效液相色譜法測定炮制前后樣品中環(huán)磷酸腺苷的含量。

1 儀器與試藥

Waters e2695高效液相色譜儀、2998型紫外檢測器（美國Waters公司）；高效液相色譜柱為Agilent TCC18（250×4.6 mm，5 μm）；高速萬能粉碎機（天津鑫博得儀器有限公司）；101型電熱鼓風(fēng)烘箱（北京科偉永興實驗有限公司）；KQ-300DE超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TG328B型分析天平（上海天平儀器廠）；溶劑過濾器（天津市津騰實驗設(shè)備有限公司）；中國藥典標(biāo)準(zhǔn)藥篩二號篩（浙江省上虞市大亨橋化驗儀器廠）。環(huán)磷酸腺苷對照品（批號為16082301），購于陜西樂博生化科技有限公司；甲醇（邁瑞爾上海實驗設(shè)備有限公司），為色譜純；磷酸二氫鉀（天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司），為分析純；水為超純水；大棗購于陜西合陽；陳醋（岐山天緣食品有限公司）；白酒（北京二鍋頭酒業(yè)股份有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 大棗炮制品的炮制方法

2.1.1 大棗生品 取同一批次的大棗搶水洗干凈，烘干，用時剖開。

2.1.2 醋蒸大棗[13]取潔凈大棗適量，剖開，加入20%的陳醋浸潤，待醋被吸收完全后，放入蒸鍋內(nèi)蒸至顏色呈暗紅色，取出放涼，干燥。

2.1.3 醋炙大棗[13]取潔凈大棗適量，剖開，加入20%的陳醋浸潤，待醋被吸收完全，文火炒干并至表面微黃色，香味溢出。

2.1.4 酒蒸大棗 取大棗適量，剖開，加入10%的酒將大棗浸潤，蒸制0.5 h放涼，取出，干燥。

2.1.5 三蒸三制 取潔凈大棗適量，至鍋內(nèi)隔水蒸制0.5 h，取出放涼，重復(fù)3次，取出，干燥即可。

2.1.6 酒炙大棗 取大棗適量，剖開，加入10%的酒將大棗浸潤，文火炒至香味溢出。

2.1.7 炒焦大棗[14]將適量大棗取出剖開，置鍋內(nèi)于武火炒至外表皮破裂，表面有焦斑。

2.2 大棗的預(yù)處理 將炮制后的大棗和生品干燥后用粉碎機粉碎，分別過二號篩，裝于密封袋中，在避光干燥處保存。

2.3 大棗中環(huán)磷酸腺苷含量的測定方法

2.3.1 色譜條件的選擇 高效液相色譜柱為Agilent TCC18（250×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.03 mol/L K2HPO3（A）-甲醇（B）溶液；梯度洗脫，梯度洗脫程序為0～25 min時10%（A）:90%（B），25～30 min時10%～50%（A）:90%～50%（B），30～40 min時50%（A）:50%（B），40～50 min時，10%（A）～90%（B）。流速為1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：254 nm；進樣量：10 μL[15]。

2.3.2 色譜峰的確定 取配制好的并且已經(jīng)過了0.45 μm微孔濾膜的環(huán)磷酸腺苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，在已經(jīng)設(shè)置好的擬定色譜條件下進樣10 μL，通過對照標(biāo)準(zhǔn)品出峰的時間和位置來分析樣品中環(huán)磷酸腺苷的出峰位置。見圖1。

圖 1 環(huán)磷酸腺苷對照品的高效液相色譜圖

2.3.3 對照品溶液的制備 精密稱定環(huán)磷酸腺苷對照品5.1 mg，置于50 mL容量瓶中，加入超純水溶解至刻度，制成混合對照液。再吸取對照品溶液4.9、2.45、1.225、0.613、0.306 mL，分別置于10 mL的容量瓶中，加超純水稀釋并定容至刻度線，配制成濃度分別為50、25、12.5、6.25、3.125 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)對照品溶液，用時再經(jīng)過0.45 μm的微孔濾膜過濾。

2.3.4 供試品溶液的制備 精密稱取炮制好的大棗粉末各1 g，置于100 mL的錐形瓶中，加入超純水20 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取40 min，冷卻，再稱重并補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，然后轉(zhuǎn)移到容量瓶中定容至25 mL，經(jīng)過0.45 μm的微孔濾膜過濾，即得供試品溶液[20]。

2.4 線性關(guān)系考察 取已制備好的不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液各10 μL注入高效液相色譜儀，測定其所對應(yīng)的峰面積。以溶液濃度為橫坐標(biāo)，測得的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制大棗環(huán)磷酸腺苷標(biāo)準(zhǔn)曲線。得出的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：Y = 21 342X+7 175.8，R2= 0.999 2（n = 5）。從結(jié)果中可以得出環(huán)磷酸腺苷含量在0.031 25～0.5 μg的范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系良好。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗 精密量取濃度為12.5 mg/L的環(huán)磷酸腺苷對照品溶液，在相同的色譜條件下注入高效液相色譜儀，每次10 μL，重復(fù)進樣6次。測定環(huán)磷酸腺苷的峰面積RSD為1.73%（n = 6），表明儀器的精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗 精密稱取已炮制處理好的醋炙后的大棗粉末1 g，按照2.3.4下的制備方法來制得1份供試品溶液，并放于室溫下密閉保存。取同一供試品溶液，分別在0、2、4、8、12 h下，于相同色譜條件中分別進樣10 μL，測定醋炙大棗中的環(huán)磷酸腺苷峰面積的RSD為1.74%，表明在12 h內(nèi)炮制大棗供試品溶液在室溫下穩(wěn)定性良好。

2.5.3 重復(fù)性實驗 精密稱取同一批酒炙的樣品，按照2.3.4下的方法制備6份供試品溶液，在相同色譜條件下進樣，進樣量為10 μL，然后分別測量環(huán)磷酸腺苷的面積并計算其含量。結(jié)果得出樣品中環(huán)磷酸腺苷含量的RSD為0.5% ，表明應(yīng)用的方法重復(fù)性良好。

2.5.4 加樣回收實驗 量取已知含量的同一炮制品粉末0.5 g，共稱取5份，精密稱定，置于錐形瓶中。再分別加入已配置好的濃度為102 mg/L的環(huán)磷酸腺苷對照品溶液1.5 mL，然后按照樣品溶液配制方法配制成供試品溶液，在同一色譜條件下分別進樣10 μL，測定環(huán)磷酸腺苷的峰面積并計算加樣回收率，平均回收率98.29%，RSD 0.74%。

2.6 樣品的含量測定 分別取已配制好的大棗生品和醋炙、酒炙、醋蒸、酒蒸、三蒸三制、炒焦的大棗炮制品供試品溶液各10 μL，在相同擬設(shè)定的色譜條件下注入高效液相色譜儀，測定大棗中環(huán)磷酸腺苷的峰面積，并按照所求得的線性回歸方程計算大棗中環(huán)磷酸腺苷的含量。見表1。

表1 不同炮制方法下大棗中環(huán)磷酸腺苷的含量

3 討論

經(jīng)與未經(jīng)炮制的大棗生品比較發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過炮制的大棗中環(huán)磷酸腺苷含量均有提高，其中經(jīng)過醋蒸的大棗環(huán)磷酸腺苷含量增加最為明顯。炮制后的環(huán)磷酸腺苷含量增加的原因可能是因為環(huán)磷酸腺苷為水溶性物質(zhì)，能與醋酒結(jié)合，而且經(jīng)過蒸制后，蒸汽里的水分進大棗內(nèi)部，使環(huán)磷酸腺苷有效溶出，增加了含量。在炒焦時，由于大棗表皮結(jié)構(gòu)緊密，經(jīng)過武火炒炙，其表皮遭到破壞后破裂，使得大棗內(nèi)部受熱面積增大，更容易讓其有效成分受熱溢出。本次實驗結(jié)果表明，運用高效液相色譜法檢測炮制大棗中環(huán)磷酸腺苷的含量，精密度高、操作簡單、可以重復(fù)檢測。

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