秦 舒，朱玉蓉

流行病學(xué)研究表明，帕金森?。≒D）患者需長(zhǎng)期服用左旋多巴和卡比多巴，其多種惡性腫瘤的發(fā)病率顯著低于正常健康人群，包括胃癌、肝癌、胰腺癌、直腸癌、前列腺癌、肺癌等，但黑色素瘤和乳腺癌除外[1]。由此推測(cè)，左旋多巴和卡比多巴是否可能具有抗癌作用。因此，針對(duì)左旋多巴進(jìn)行了大量的研究，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果并未證實(shí)左旋多巴具有抑制多種惡性腫瘤的作用[2]。但研究發(fā)現(xiàn)，卡比多巴的化學(xué)結(jié)構(gòu)與苯肼十分相似。苯肼是吲哚胺-2,3-雙加氧酶1（IDO1）的一種抑制劑，而IDO1則是細(xì)胞內(nèi)色氨酸降解代謝的主要催化酶，其代謝產(chǎn)物犬尿氨酸又是芳香烴受體(AhR)的生理激活劑[3]。與此同時(shí)，大量相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明，AhR參與細(xì)胞增殖、凋亡及免疫代謝[4-6]，直接影響腫瘤的黏附、生長(zhǎng)、遷移和侵襲。因此，不難提出假設(shè)，卡比多巴是否是通過影響AhR的活性來發(fā)揮抗癌作用。我國(guó)是乙肝大國(guó)，每年約有22萬人死于原發(fā)性肝癌，其死亡率在惡性腫瘤中排名第2[7]。本實(shí)驗(yàn)建立肝癌HepG2細(xì)胞株的離體模型，通過不同濃度卡比多巴的干預(yù)，觀察HepG2細(xì)胞的增殖能力、AhR的激活以及CYP1A1、CYP1A2、CYP1B1等靶基因轉(zhuǎn)錄水平的變化，借此驗(yàn)證卡比多巴是否具有抗癌作用，并探索其可能的藥理機(jī)制，以期為肝癌的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要細(xì)胞及儀器、試劑 人肝癌HepG2細(xì)胞株，購自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)；胎牛血清（德國(guó)Biochrom公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco 公司）；卡比多巴、MTT、DMSO（美國(guó) Sigma公司）；自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó) BIO-RAD 550型）；高容量cDNA合成試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)；引物序列（中國(guó)華大基因）；Alexa Fluor 488、DAPI(美國(guó) Molecular Probes公司)；Ⅰ、Ⅱ抗（美國(guó) Abcam 公司）；熒光顯微鏡（瑞士MMI公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) HepG2細(xì)胞株在37℃條件下，使用DMEM高糖培養(yǎng)基（10%的胎牛血清、青霉素100 IU/ml、鏈霉素 100 g/L），在 5%CO2的環(huán)境中培養(yǎng)，并傳代10～20代。所有實(shí)驗(yàn)均采用處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，并重復(fù)3次。

1.3 MTT法測(cè)定細(xì)胞生存率 取HepG2細(xì)胞接種于96孔板中，每孔1×104個(gè)細(xì)胞，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。然后按實(shí)驗(yàn)要求分別加入終濃度為0、1、2.5、5、7.5、10、12.5、15 μM 的卡比多巴。 以上各組每天棄上清，并更換一次卡比多巴，2 w后終止培養(yǎng)。向每個(gè)孔中加入MTT(20 μl，5 g/L)和DMEM培養(yǎng)液（180 μl， 無血清）； 繼續(xù)培養(yǎng) 4 h 后， 加入 150 μl DMSO，37℃下溶解10 min。然后放入自動(dòng)酶標(biāo)儀，測(cè)定吸光度值（A570nm），并按照下面的公式計(jì)算細(xì)胞生存率：細(xì)胞生存率=（實(shí)驗(yàn)組A570nm值）/（對(duì)照組A570nm值）×100%。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（qRT-PCR）測(cè)定細(xì)胞中CYP1A1、CYP1A2和 CYP1B1 mRNA的表達(dá) 取HepG2細(xì)胞，將其制成單細(xì)胞懸液，以每孔1.8×105個(gè)細(xì)胞接種6孔板，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好后，分別加入卡比多巴（0、10、50 μM）、CH223191（0、10 μM），作用6 h，提取各組細(xì)胞的RNA。使用高容量cDNA合成試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。引物序列見表1。反應(yīng)條件：預(yù)變性 95 ℃，30 s；變性 95 ℃，5 s；退火、延伸60℃，30 s， 共40個(gè)循環(huán)；65～95℃（每次增加0.5℃）測(cè)定熔解曲線。擴(kuò)增得到的Ct值使用2-ΔΔCt法計(jì)算目的mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 免疫熒光觀察AhR表達(dá) 使用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，加入Ⅰ抗（小鼠抗 AhR 抗體）（1∶50），在4℃條件下孵育45 min；再加入Ⅱ抗（羊抗鼠IgG，綠色）（1∶400）在37 ℃條件下孵育 2 h；接著加入 DAPI染色5 min；然后在熒光顯微鏡下觀察。

表1 PCR引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0軟件分析，計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LST-t檢驗(yàn)，假設(shè)檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度卡比多巴對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用不同濃度的卡比多巴 （1、2.5、5、7.5、10、12.5、15 μM）對(duì)HepG2細(xì)胞增殖均有顯著的抑制作用（P<0.05），且呈現(xiàn)濃度依賴性（圖 1）。

圖1 不同濃度卡比多巴對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

2.2 不同濃度卡比多巴對(duì) CYP1A1、CYP1A2和CYP1B1基因表達(dá)的影響 卡比多巴顯著增加了CYP1A1、CYP1A2和 CYP1B1 mRNA 的含量(P<0.05)，且呈現(xiàn)顯著的濃度依賴性（圖 2、3）。

圖2 不同濃度卡比多巴對(duì)于CYP1A1 mRNA表達(dá)水平的影響

圖3 不同濃度卡比多巴對(duì)于CYP1A2和CYP1B1 mRNA表達(dá)水平的影響

2.3 CH223191抑制卡比多巴的阻斷作用 卡比多巴可顯著增加CYP1A1 mRNA的相對(duì)水平（P<0.05）；加入 CH223191（AhR 的特異性拮抗劑）后，可有效阻斷卡比多巴對(duì)于CYP1A1基因表達(dá)的激活作用（P<0.05，圖 4）。

圖4 CH223191阻斷卡比多巴對(duì)于CYP1A1基因表達(dá)的激活作用

2.4 卡比多巴處理導(dǎo)致AhR的激活 免疫組化染色顯示，相比于空白對(duì)照組，卡比多巴處理的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞核（藍(lán)色）中出現(xiàn)了AhR（綠色），提示AhR被激活，并發(fā)生核轉(zhuǎn)移（圖5）。

圖5 卡比多巴激活A(yù)hR并發(fā)生核轉(zhuǎn)移（×100）

3 討論

卡比多巴通過抑制外周多巴脫羧酶來防止左旋多巴轉(zhuǎn)化為無法通過血腦屏障的多巴胺[8]，從而喪失藥效。因此，其多與左旋多巴配伍，常用于PD的輔助治療。臨床推薦用量為50～100 mg/d，但即使將其用量提高到450 mg/d，仍具有很高的安全性[9]，證明其毒副作用小。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，較低濃度（1 μM）的卡比多巴即可顯著抑制HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，且呈現(xiàn)濃度依賴性，證實(shí)其具有高效的抗癌作用。

受到卡比多巴分子結(jié)構(gòu)的啟發(fā)，推測(cè)其藥理作用的靶點(diǎn)可能是AhR。它是一種配體依賴性的轉(zhuǎn)錄因子，通過與不同配體的結(jié)合而激活，后以異二聚體復(fù)合物的形式發(fā)生核轉(zhuǎn)移，通過經(jīng)典/非經(jīng)典多條信號(hào)傳導(dǎo)通路激活下游靶基因[10]。研究表明，AhR在多種腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，包括肝癌[11]。AhR活化后改變腫瘤細(xì)胞周期，促進(jìn)其生長(zhǎng)增殖，并抑制凋亡[5]；同時(shí)降低其的接觸能力，增加轉(zhuǎn)移和侵襲的可能[12]。陳艷美等[13]利用RNA干擾HCCLM3細(xì)胞中的AhR，發(fā)現(xiàn)HCCLM3細(xì)胞的增殖和遷移能力顯著降低；將RNA干擾的HCCLM3細(xì)胞注射到裸鼠體內(nèi)，其腫瘤生長(zhǎng)也受到了顯著的抑制。本實(shí)驗(yàn)通過免疫組化染色顯示，卡比多巴引起了AhR激活并發(fā)生核轉(zhuǎn)移；RT-PCR結(jié)果顯示，卡比多巴導(dǎo)致3種目標(biāo)基因 CYP1A1、CYP1A2和 CYP1B1 mRNA水平的增高。同時(shí)，添加CH223191可有效阻斷了CYP1A1的轉(zhuǎn)錄，這些均證明卡比多巴是通過激活A(yù)hR來發(fā)揮其抗腫瘤作用，這與文獻(xiàn)描述相矛盾。究其原因，可能是因?yàn)锳hR具有配體依賴性和雙重調(diào)控性。配體依賴性是指不同類型的配體同樣作用于AhR，但最終可能產(chǎn)生促癌和抑癌兩種截然不同的結(jié)果，如多環(huán)芳烴、鹵代芳烴等配體結(jié)合AhR后，主要發(fā)揮促癌作用；而苯并噻唑、氨基黃酮等配體結(jié)合AhR后，則主要發(fā)揮抑癌作用[14]。雙重調(diào)控性是指同一種配體在兩種不同的環(huán)境中與AhR結(jié)合，但結(jié)果可能分別表現(xiàn)為活化和抑制AhR，如山柰酚在MCF-7細(xì)胞中表現(xiàn)為AhR的激動(dòng)劑，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡；而在含有TCDD的環(huán)境中，山柰酚則表現(xiàn)為AhR的拮抗劑，減少代謝毒物，發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用[15]?？ū榷喟涂赡芫褪且环N特異性配體，通過與AhR結(jié)合，誘導(dǎo)其構(gòu)象改變，活化并產(chǎn)生抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的生物學(xué)效應(yīng)。但具體的作用機(jī)制尚不清楚，有待在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步深入研究。

[1] Disse M,Reich H,Lee PK,et al.A review of the association between parkinson disease and malignant melanoma[J].Dermatologic Surgery,2016,42(2):141.

[2] Inzelberg R,Israelikorn SD.The particular relationship between Parkinson's disease and malignancy:a focus on skin cancers[J].Journal of Neural Transmission,2009,116(11):1503-1507.

[3] 徐躍洋,吳俊軍.吲哚胺-2,3-雙加氧酶IDO1抑制劑研究進(jìn)展[J].中國(guó)新藥雜志,2016(4):425-432.

[4] KalmesM,Hennen J,ClemensJ,etal.Impactofaryl hydrocarbon receptor(AhR)knockdown on cell cycle progression in human HaCaT keratinocytes[J].Biological Chemistry,2011,392(7):643-651.

[5] Miglio G,Rosa AC,Rattazzi L,et al.Protective effects of peroxisome proliferator-activated receptor agonists on human podocytes:proposed mechanisms of action[J].British Journal of Pharmacology,2012,167(3):641.

[6] 李善寶,徐軍明.色氨酸2,3-雙加氧酶在色氨酸分解代謝及免疫調(diào)節(jié)中的作用[J].國(guó)際外科學(xué)雜志,2016,43(7):491-494.

[7] 陳冬,王仁本.原發(fā)性肝癌外放療臨床應(yīng)用現(xiàn)狀[J].中華腫瘤防治雜志,2015,22(1):76-80.

[8] Ahlskog JE,Muenter MD.Frequency of levodopa-related dyskinesias and motor fluctuations as estimated from the cumulative literature[J].Movement Disorders,2001,16(3):448-458.

[9] Brod LS,Aldred JL,Nutt JG.Are high doses of carbidopa a concern?A randomized clinical trial in Parkinson's disease[J].Movement Disorders,2012,27(6):750-753.

[10] Esser C.The Aryl Hydrocarbon receptor in immunity:tools and potential[M]//Suppression and Regulation of Immune Responses.Springer New York,2016:239-257.

[11] Liu Z,Wu X,Zhang F,et al.AhR expression is increased in hepatocellular carcinoma [J].Journal of Molecular Histology,2013,44(4):455-461.

[12] Ishida M,Mikami S,Kikuchi E,et al.Activation of the aryl hydrocarbon receptor pathway enhances cancer cell invasion by upregulating the MMP expression and is associated with poor prognosis in upper urinary tract urothelial cancer[J].Carcinogenesis,2010,31(2):287-295.

[13] 陳艷美,姜燕.AHR小干擾RNA對(duì)肝癌HCCLM3細(xì)胞體外增殖和體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的影響[J].腫瘤,2014,34(3):223-230.

[14] 何珩,張智慧.AHR與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)性的研究進(jìn)展[J].腫瘤預(yù)防與治療,2017,30(3):226-231.

[15] Safe S,Lee SO,Jin UH.Role of the aryl hydrocarbon receptor in carcinogenesis and potential as a drug target[J].Toxicological Sciences,2013,135(1):1.