周小琴 盧瑞芯 司徒少金 湯丹

摘要：目的 建立快速同時測定梔子藥材中梔子苷和西紅花苷-1含量的分析方法。方法 采用常規(guī)液相色譜儀系統(tǒng)，Agilent Poroshell 120 EC-C18核殼色譜柱（100 mm×4.6 mm，2.7 ?m），流動相為乙腈-0.2%甲酸水溶液，梯度洗脫，檢測波長時間程序為240 nm（0～7 min）、440 nm（7～14 min）。采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對色譜圖中的主要成分進行指認(rèn)。結(jié)果 梔子苷和西紅花苷-1分別在0.2～6.0 ?g和0.04～1.2 ?g進樣量范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（r=0.999 9）；儀器精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗RSD均小于3%；平均加樣回收率分別為99.89%和101.74%，RSD均小于3%。采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對色譜圖中的8個主要成分進行了指認(rèn)，包括3個環(huán)烯醚萜類成分和5個西紅花酸類成分。結(jié)論 該方法簡便、快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可為建立高效的梔子藥材質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：梔子；梔子苷；西紅花苷-1；快速分析

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.05.019

中圖分類號：R284.1 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）05-0086-04

Rapid Determination of Geniposide and Crocin-1 in Gardeniae Fructus

Based on Core Shell Chromatographic Column

ZHOU Xiao-qin1， LU Rui-xin1， SITU Shao-jin1， TANG Dan2

1. Guangzhou Baiyunshan Mingxing Pharmaceutical Co.， Ltd.， Guangzhou 510250， China；

2. College of Pharmacy， Jinan University， Guangzhou 510632， China

Abstract： Objective To establish a rapid method for simultaneous determination of geniposide and crocin-1 in Gardeniae Fructus. Methods A conventional liquid chromatography system was used. An Agilent Poroshell 120 EC-C18 column （100 mm × 4.6 mm， 2.7 ?m） was used with the mixture of acetonitrile-0.2% formic acid solution as the mobile phase in gradient elution. Detection wavelength was as follow： 240 nm （0–7 min）， 440 nm （7–14 min）. At the same time HPLC-MS/MS technology was used to identify the main components of the chromatogram. Results The calibration curves of geniposide and crocin-1 were in good linearity among the ranges of 0.2–6.0 ?g and 0.04–1.2 ?g， respectively （r=0.999 9）. For the precision test， stability test， repeatability test， the RSD were less than 3%. The average recoveries were 99.89% and 101.74%， respectively， and all the RSD were less than 3%. Eight major components were identified by HPLC-MS/MS technology， including three iridoids and five crocetin derivatives. Conclusion The developed method is simple， rapid， accurate and reproducible， which can provide a basis for quality evaluation of Gardeniae Fructus.

Keywords： Gardeniae Fructus； geniposide； crocin-1； rapid analysis

梔子為茜草科植物梔子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果實，具有瀉火除煩、清熱利尿、涼血解毒等功效。研究表明，梔子中含量較高且具有較強藥理活性的成分主要有2大類，即以梔子苷為代表

基金項目：國家科技重大專項（2011ZX09201-201-07）

通訊作者：湯丹，E-mail：tdpharm@126.com

的環(huán)烯醚萜類和以西紅花苷為代表的西紅花酸類成分[1-2]。梔子苷具有抗炎、利膽等作用[3]，西紅花苷在抗炎、抗心肌缺血、抗血栓、抗動脈粥樣硬化、降血脂等方面具有顯著的藥理作用[4]。

在前期系列工作基礎(chǔ)上[5-6]，為提高檢驗效率、降低成本，本研究引入新型的核殼色譜柱，基于常規(guī)HPLC系統(tǒng)，建立同時測定梔子中2種主要成分梔子苷和西紅花苷-1的快速分析方法，對梔子道地產(chǎn)區(qū)的樣品進行含量測定，同時采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對色譜圖中的主要成分進行指認(rèn)。

1 儀器與試藥

Aglient1200型高效液相色譜儀（配備在線脫氣四元泵、自動進樣器、柱溫箱、DAD檢測器），島津LCMS-8040三重四極桿質(zhì)譜儀，MUS/1006型超聲波清洗器（深圳現(xiàn)代超聲實業(yè)有限公司），A&DER-180A;型萬分之一分析天平（日本A&D;公司）。

梔子苷（批號110749-201316）、西紅花苷-1（批號111588-201303）對照品，中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇為色譜純，德國Merck公司；甲酸為分析純，廣州市化學(xué)試劑廠；水為超純水，其他試劑均為分析純。6批梔子藥材均來自道地產(chǎn)區(qū)江西，購自廣州市采芝林藥業(yè)有限公司，批號分別為160510、160702、160706、161001、161007、161103，經(jīng)廣州白云山明興制藥有限公司中心化驗室陳文榮高級工程師鑒定為茜草科植物梔子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果實。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Agilent Poroshell 120 EC-C18色譜柱（2.7 ?m，100 mm×4.6 mm），流動相為0.2%甲酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～7 min，7%～30%B；7～14 min，30%～75%B），流速為1.0 mL/min，檢測波長為240 nm（0～7 min）、440 nm（7～14 min），柱溫為40 ℃，進樣量為10 ?L。

2.2 質(zhì)譜條件

正離子模式檢測；霧化氣和干燥氣均為氮氣；干燥氣流速10 L/min；霧化氣流速3 L/min；脫溶劑管溫度為300 ℃，加熱模塊溫度為400 ℃；毛細管電壓3 kV；全掃描范圍為m/z 100～1200；柱后分流，流動相進入質(zhì)譜檢測器的量為0.5 mL/min。

2.3 對照品溶液的制備

分別精密稱取適量梔子苷和西紅花苷-1對照品，置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，配制成含梔子苷1.0 mg/mL和西紅花苷-1 0.2 mg/mL的混合對照品溶液，備用。

2.4 供試品溶液的制備

取梔子樣品干燥粉末（過40目篩）0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇（V/V）50 mL，密塞，搖勻，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率300 W，頻率30 kHz）40 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用80%甲醇（V/V）補足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.45 ?m微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，作為供試品溶液，備用。

2.5 系統(tǒng)適用性試驗

精密量取混合對照品溶液和供試品溶液各10 ?L，分別注入色譜儀，記錄色譜圖，見圖1。結(jié)果理論塔板數(shù)按梔子苷和西紅花苷-1計算均不低于3000，2種成分色譜峰與相鄰峰之間分離度均大于1.5，對稱因子在0.95～1.05范圍內(nèi)，樣品中其他成分不干擾待測成分的測定。

A

B

注：A.對照品；B.供試品；3.梔子苷；4.西紅花苷-1

圖1 梔子中梔子苷和西紅花苷-1 HPLC圖

2.6 色譜峰的指認(rèn)

吸取各供試品溶液1 ?L，記錄質(zhì)譜信號。在HPLC-MS/MS分析過程中，通過分析ESI-MS/MS提供的化合物保留時間、分子量信息、質(zhì)譜裂解碎片的種類等信息，并結(jié)合對照品比對以及文獻數(shù)據(jù)[7-8]，對色譜圖中波長240 nm和440 nm處的8個主要成分進行結(jié)構(gòu)鑒定，包括3個環(huán)烯醚萜類成分和5個西紅花酸類成分。結(jié)果見表1。

2.7 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.4”項下混合對照品溶液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，分別置于5 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，依次注入液相色譜儀，測定色譜峰面積，以對照品濃度（?g/mL）為橫坐標(biāo)，色譜峰面積積分值為縱坐標(biāo)，進行線性回歸，得回歸方程。梔子苷：Y=11.714X+4.173（r=0.999 9），西紅花苷-1：Y=30.757X+12.105（r=0.999 9）。結(jié)果表明，梔子苷和西紅花苷-1進樣量分別在0.2～6.0 ?g和0.04～1.2 ?g范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.8 精密度試驗

取同一混合對照品溶液10 ?L，按上述色譜條件連續(xù)進樣6次測定。結(jié)果梔子苷和西紅花苷-1峰面積RSD分別為0.8%、0.5%，表明儀器精密度良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗

取同一批次的供試品溶液，放置于室溫，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣10 ?L進行分析，記錄峰面積。結(jié)果梔子苷和西紅花苷-1的峰面積RSD分別為1.1%、2.0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 重復(fù)性試驗

取同一批梔子樣品6份，精密稱定，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，進樣10 ?L，以外標(biāo)兩點法計算梔子苷和西紅花苷-1的含量，結(jié)果2種成分含量平均值分別為5.18%、0.68%，RSD分別為1.2%、1.7%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.11 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的梔子樣品粉末6份，每份100 mg，精密稱定，分別加入相當(dāng)于樣品中梔子苷和西紅花苷-1含量的對照品溶液適量。按“2.4”項下方法制備供試品溶液，進樣10 ?L測定，計算梔子苷和西紅花苷-1的回收率和RSD。結(jié)果見表2。

2.12 樣品含量測定

精密稱取6批梔子樣品粉末0.2 g，按“2.5”項下方法制備供試品溶液，進樣10 ?L，每個溶液進樣3次，計算各樣品中梔子苷和西紅花苷-1的含量。結(jié)果見表3。

3 討論

近年來，基于核殼技術(shù)的新型Agilent Poroshell 120色譜柱通過獨特的填料結(jié)構(gòu)，擁有較高的柱效性能，同時柱壓較低，使其能在常規(guī)液相系統(tǒng)上實現(xiàn)快速高效分離。針對梔子苷和西紅花苷-1的同時定量分析，常規(guī)HPLC分析方法的時間達40 min[9-10]。本研究運用該新型色譜柱，成功實現(xiàn)了在常規(guī)液相系統(tǒng)上14 min內(nèi)快速分析梔子成分的目的，分析時間明顯縮短，大幅改善液相色譜的分離度、靈敏度，節(jié)省化學(xué)試劑，提高工作通量，從而節(jié)約分析成本，使液相色譜的分離能力得到進一步延伸和擴展，可極大提高分析工作的質(zhì)量和效率，應(yīng)用前景廣闊。

全波長（200～600 nm）掃描發(fā)現(xiàn)，梔子苷在波長240 nm處有最大吸收，而西紅花苷-1在440 nm處呈最大吸收。兩類成分的最大吸收波長不同，同時結(jié)合文獻及本研究中的HPLC-MS/MS圖譜，環(huán)烯醚萜類成分先于西紅花酸類成分，且兩類成分互不干擾。因此，采用常見的可變單波長檢測器，通過設(shè)定時間程序改變檢測波長，選取7 min為檢測波長轉(zhuǎn)換點，使檢測波長由240 nm變?yōu)?40 nm，實現(xiàn)了一張色譜圖同時呈現(xiàn)梔子中環(huán)烯醚萜類和西紅花酸類兩大類主成分的目的，更加方便直觀。

本研究基于新型表面多孔填料技術(shù)色譜柱，采用常規(guī)HPLC系統(tǒng)結(jié)合程序變波長法同時測定了梔子中梔子苷和西紅花苷-1的含量，應(yīng)用該方法測定了6批道地產(chǎn)區(qū)梔子樣品中上述2種成分的含量。同時還采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對色譜圖中的8個主要峰進行了指認(rèn)。本研究建立的含量測定方法分析時間短、重復(fù)性好、精密度高、專屬性強，且常規(guī)儀器即可滿足，適用面更廣。

參考文獻：

[1] 那莎，郭國田，王宗殿，等.梔子及其有效成分藥理研究進展[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2005，12（1）：90-92.

[2] XIAO W， LI S， WANG S， et al. Chemistry and bioactivity of Gardenia jasminoides[J]. J Food Drug Anal，2017，25（1）：43-61.

[3] 游偉良，平其能，孫敏捷，等.梔子苷的藥理學(xué)研究新進展[J].藥學(xué)進展，2012，36（4）：158-162.

[4] 韓宇，謝國勇，李冉，等.西紅花苷藥理活性的研究進展[J].現(xiàn)代藥物與臨床，2017，32（9）：1806-1814.

[5] 畢志明，周小琴，湯丹，等.內(nèi)標(biāo)校正法在中藥梔子多成分同時定量分析中的應(yīng)用[J].中國藥科大學(xué)學(xué)報，2010，41（1）：50-54.

[6] 王莎，周小琴，司徒少金，等.梔子藥材環(huán)烯醚萜類和西紅花酸類成分HPLC指紋圖譜研究[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2012，18（19）：85-88.

[7] WANG L， LIU S， ZHANG X， et al. A strategy for identification and structural characterization of compounds from Gardenia jasminoides by integrating macroporous resin column chromatography and liquid chromatography-tandem mass spectrometry combined with ion-mobility spectrometry[J]. J Chromatogr A，2016，1452：47-57.

[8] 王曉燕，張麗，王添琦，等.梔子化學(xué)成分的UHPLC-Q-TOFMS分析[J].中藥材，2013，36（3）：407-410.

[9] 鄧紹勇，賀義昌，朱培林，等.梔子野生群體梔子苷及西紅花苷-1含量分析[J].中藥材，2016，39（7）：1493-1498.

[10] 杜偉鋒，梁小娟，吳晶宇，等.梔子炮制前后綠原酸、梔子苷和西紅花苷-Ⅰ的比較[J].中草藥，2011，42（10）：2008-2010.

（收稿日期：2017-11-02）

（修回日期：2017-11-23；編輯：陳靜）