徐誼 唐詩(shī)聰 周鑫 徐祥 黃耀元 王守峰 潘泓

人源性肺癌組織移植瘤模型是目前常用的移植瘤模型，該模型的移植瘤與原發(fā)腫瘤在組織學(xué)形態(tài)、免疫組織化學(xué)以及基因表型上可保持一致，可高度模擬人體內(nèi)環(huán)境，有利于研究腫瘤與間質(zhì)的相互作用、篩選新型的腫瘤治療藥物及藥物療效評(píng)價(jià)，為肺癌患者提供個(gè)體化治療［1］。但目前非小細(xì)胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）人源性移植瘤（patientderived xenografts，PDX）模型成瘤率較低，成本較高，每個(gè)樣本需移植大量受體鼠，且制備時(shí)間長(zhǎng)，需觀察2～16個(gè)月才能判斷模型是否成功［2］。本研究探討NSCLC組織在裸鼠皮下PDX模型的成瘤性，并分析其與原發(fā)腫瘤臨床病理特征的關(guān)系，以期在構(gòu)建NSCLC PDX模型前或構(gòu)建模型過(guò)程中篩選合適的癌組織，提高成瘤率。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 NSCLC組織標(biāo)本 隨機(jī)選取廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胸外科2016年7月至2017年1月經(jīng)手術(shù)切除的15例原發(fā)性NSCLC組織，均為初診且經(jīng)病理學(xué)檢查明確診斷，術(shù)前未行放化療，其中腺癌7例、鱗癌6例、大細(xì)胞癌2例；低分化6例、中分化6例、高分化3例。所有組織標(biāo)本均在手術(shù)中無(wú)菌獲取。本研究獲廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑 裸鼠購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，4～6周齡，體重 18～22 g，在SPF級(jí)條件下飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)所需HBSS緩沖液和胎牛血清購(gòu)自Invitrogen公司，人源和鼠源目的基因引物及人源、鼠源β-actin內(nèi)參均購(gòu)自廣西科迪試劑公司。鼠抗人Ki-67、p63、細(xì)胞角蛋白 5/6（cytokeratin 5/6，CK5/6）和甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子-1（thyoid transcription factor-1，TTF-1）即用型單克隆抗體（一抗）、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（二抗）、SP檢測(cè)試劑盒及DAB顯色試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 NSCLC PDX模型的建立 本課題組前期研究已成功構(gòu)建NSCLC PDX模型，具體實(shí)驗(yàn)步驟見(jiàn)前期報(bào)道［3-4］。同時(shí)收集15例移植瘤模型對(duì)應(yīng)患者的年齡、性別等一般情況以及原發(fā)腫瘤的病理類型、分化程度、TNM分期等臨床病理資料。

1.2.2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)TTF-1、p63、CK5/6、Ki-67蛋白的表達(dá) NSCLC PDX模型對(duì)應(yīng)的NSCLC患者原發(fā)腫瘤組織以4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，分別進(jìn)行常規(guī)HE染色和免疫組織化學(xué)法染色。免疫組織化學(xué)法染色采用SP兩步法：切片脫蠟至水；高壓熱修復(fù)，自然冷卻；置于3%H2O2溶液10 min，滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；PBS清洗2 min×3次，分別滴加鼠抗人Ki-67、p63、CK5/6和TTF-1單克隆抗體，置于4℃冰箱過(guò)夜；PBS清洗2 min×3次，滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG，37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng) 20 min；PBS清洗 2 min×3次，DAB 顯色；蒸餾水沖洗，蘇木精對(duì)比染色細(xì)胞核，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照為已知陽(yáng)性的標(biāo)本。

1.2.3 結(jié)果判定 TTF-1、Ki-67和p63蛋白均定位于細(xì)胞核，CK5/6定位于細(xì)胞質(zhì)，陽(yáng)性染色均呈（棕）黃色顆粒。免疫組織化學(xué)法染色結(jié)果由2位病理科醫(yī)師采用雙盲法觀察每張切片，定性分析患者腫瘤組織中TTF-1、Ki-67、p63和CK5/6的表達(dá)情況。以腫瘤細(xì)胞增殖最旺盛的5個(gè)高倍視野（×400）計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比。當(dāng)腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)小于10%且沒(méi)有局灶區(qū)域呈陽(yáng)性表達(dá)時(shí)記為陰性；腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)大于10%記為陽(yáng)性；細(xì)胞幾乎全部表達(dá)陰性但局灶區(qū)域呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)記為局灶陽(yáng)性，局灶陽(yáng)性亦歸為陽(yáng)性［5］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較成瘤組和未成瘤組所對(duì)應(yīng)腫瘤組織患者的年齡、腫瘤大小等；采用fisher確切概率法比較兩組腫瘤組織的分化程度、TNM分期和Ki-67、TTF-1、p63、CK5/6表達(dá)率。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC PDX模型成瘤性與對(duì)應(yīng)患者臨床病理特征的關(guān)系

15例NSCLC組織在裸鼠皮下移植后成瘤6例，成瘤率為40%。分析成瘤性與對(duì)應(yīng)患者主要臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果顯示，NSCLC PDX模型成瘤性與對(duì)應(yīng)患者的TNM分期和腫瘤分化程度相關(guān)（P＜0.05），但與患者年齡、性別、吸煙情況、腫瘤大小以及組織學(xué)類型等無(wú)關(guān)（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 NSCLC PDX模型對(duì)應(yīng)NSCLC組織中p63、TTF-1、CK5/6和Ki-67蛋白的表達(dá)

對(duì)應(yīng)NSCLC組織的HE及免疫組化染色結(jié)果（圖1）顯示，TTF-1蛋白定位于細(xì)胞核，陽(yáng)性染色呈（棕）黃色顆粒，成瘤組TTF-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高于未成瘤組（83%vs 22%，P=0.041）；p63蛋白定位于細(xì)胞核，陽(yáng)性染色呈（棕）黃色顆粒，成瘤組中p63蛋白陽(yáng)性表達(dá)率低于未成瘤組（50%vs 100%，P=0.041）；CK5/6定位于細(xì)胞質(zhì)，陽(yáng)性染色呈（棕）黃色顆粒，成瘤組中CK5/6蛋白陽(yáng)性表達(dá)率與未成瘤組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（33%vs 44%，P=0.315）；Ki-67蛋白定位于細(xì)胞核，陽(yáng)性染色呈（棕）黃色顆粒，成瘤組中Ki-67蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高于未成瘤組（100%vs 22%，P=0.007），見(jiàn)表2。

表1 NSCLC PDX模型成瘤性與對(duì)應(yīng)患者臨床病理特征的關(guān)系［n（%）］

表2 NSCLC PDX模型對(duì)應(yīng)NSCLC組織中p63、TTF-1、CK5/6和Ki-67蛋白的表達(dá)［n（%）］

圖1 對(duì)應(yīng)NSCLC組織中p63、TTF-1、CK5/6和Ki-67蛋白的表達(dá)（HE 染色，×400）

3 討論

肺癌裸鼠移植瘤模型的原位移植及腎包膜下移植均有較高的成瘤率，但這兩種方法均需熟練操作，且肉眼難以直視觀察成瘤情況，不利于推廣［3，6］。本研究采用的裸鼠皮下移植成瘤是目前常用的建模方法，成瘤率為20%～40%。本課題組前期研究［3-4］已證明，采用此方法建立的移植瘤模型在生物學(xué)特性上可與原腫瘤保持一致性。Perez-Soler等［7］將100例肺癌組織接種于裸鼠皮下，建模成功率為34%。Fichtner等［8］將102例肺癌組織接種于NOD/SCID祼鼠皮下，建模成功率為24.5%。本研究15例NSCLC組織在裸鼠皮下移植后成瘤6例，成瘤率為40%，與上述報(bào)道的成瘤率相當(dāng)，提示采用此法建模正確，成功率較高。

文獻(xiàn)報(bào)道，NSCLC組織在裸鼠皮下成瘤性與原發(fā)腫瘤自身侵襲性和惡性程度相關(guān)，且移植成瘤對(duì)應(yīng)的患者易復(fù)發(fā)，預(yù)后較差［9］。本研究比較成瘤組與未成瘤組對(duì)應(yīng)患者的臨床病理特征，發(fā)現(xiàn)分期較高及腫瘤分化程度較低的NSCLC組織更易成瘤，提示NSCLC PDX模型成瘤率可能與原發(fā)腫瘤的侵襲性及惡性程度相關(guān)。

TTF-1又稱甲狀腺特異性增強(qiáng)子結(jié)合蛋白，是一種在甲狀腺、肺和間腦早期發(fā)育過(guò)程中表達(dá)的組織特異性轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控多種基因表達(dá)，亦是評(píng)價(jià)NSCLC侵襲性的有效指標(biāo)［10］。Ki-67作為標(biāo)記細(xì)胞增殖狀態(tài)的抗原，近年已廣泛用于腫瘤細(xì)胞增殖活性研究，與其他標(biāo)記細(xì)胞增殖活性的方法相比，標(biāo)記Ki-67抗原更簡(jiǎn)單、可靠和準(zhǔn)確。羅朋等［11］研究發(fā)現(xiàn)Ki-67高表達(dá)的腫瘤組織易移植成瘤。p63常表達(dá)于上皮組織基底層，在正常上皮組織的形成中發(fā)揮重要作用。p63基因在結(jié)構(gòu)上與p53基因具有高度同源性，是p53基因家族的一員。研究發(fā)現(xiàn)p63表達(dá)與肺癌侵襲性和轉(zhuǎn)移性等生物學(xué)特性相關(guān)［12］。本研究探討NSCLC PDX模型成瘤性與對(duì)應(yīng)來(lái)源NSCLC癌組織中TTF-1、p63、CK5/6、Ki-67蛋白表達(dá)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)成瘤組TTF-1和Ki-67蛋白表達(dá)水平明顯高于未成瘤組，推測(cè)TTF-1、Ki-67可能是原癌基因，通過(guò)調(diào)節(jié)TTF-1、Ki-67表達(dá)促進(jìn)NSCLC細(xì)胞增殖、侵襲，從而更易在裸鼠體內(nèi)成瘤。然而p63表達(dá)水平明顯低于未成瘤組，提示p63可能是抑癌基因，其低表達(dá)可能與NSCLC發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，但具體機(jī)制尚未清楚。研究發(fā)現(xiàn)CK5/6陽(yáng)性表達(dá)在腫瘤體積更大或鄰近組織受累范圍更大時(shí)顯著升高，而淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度越高陽(yáng)性表達(dá)越低，認(rèn)為CK5/6可能與腫瘤生長(zhǎng)、浸潤(rùn)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)［12］。但本研究未發(fā)現(xiàn)成瘤組和未成瘤組CK5/6表達(dá)的差異性，可能與樣本量不足有關(guān)。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)分期較高和腫瘤分化程度較低的NSCLC組織在裸鼠皮下更易成瘤。因此，在構(gòu)建PDX模型前或構(gòu)建過(guò)程中，應(yīng)綜合原發(fā)腫瘤分期、分化程度及TTF-1、Ki-67、p63的表達(dá)情況，篩選合適的NSCLC組織，以提高成瘤率。但本研究樣本量較小，有關(guān)結(jié)論仍待進(jìn)一步證實(shí)。

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