侯偉楠 周艷瓊 李昌龍 朱敏 黃東海 羅麗紅 梁銳

神經(jīng)病理性疼痛是由神經(jīng)系統(tǒng)損傷引起的一種慢性疼痛疾病，主要臨床表現(xiàn)為痛覺過敏、觸誘發(fā)痛和自發(fā)性疼痛［1］。腫瘤患者在疾病發(fā)生發(fā)展中常因腫瘤壓迫、侵襲周圍神經(jīng)等誘導(dǎo)神經(jīng)病理性疼痛，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量及預(yù)后。目前神經(jīng)病理性疼痛的研究熱點(diǎn)之一是促炎因子產(chǎn)生神經(jīng)炎癥［2］，但促炎因子的激活、炎癥因子的來源尚未明了。受體相互作用蛋白激酶3（receptor-interacting protein kinase 3，RIP3）是調(diào)控程序性壞死和炎性因子的關(guān)鍵蛋白。有學(xué)者報(bào)道［3-5］RIP3在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，可通過多種途徑介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。本研究通過觀察大鼠脊神經(jīng)結(jié)扎神經(jīng)病理性疼痛模型中RIP3的表達(dá)，探討其在神經(jīng)性病理性疼痛發(fā)病機(jī)制中的作用，為神經(jīng)病理性疼痛研究、改善腫瘤患者的生活狀態(tài)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

抑制劑GSK'872購(gòu)自MedChem Express公司，RIP3抗體購(gòu)自Abcam公司，GAPDH購(gòu)于CST公司，TNF-α、IL-1β ELISA試劑盒購(gòu)自欣博盛公司，即用型免疫組化試劑盒購(gòu)自邁新公司；BCA蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物公司，電泳轉(zhuǎn)膜設(shè)備購(gòu)于Bio-rad，電動(dòng)組織研磨器購(gòu)于天根公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

選取健康雄性SD大鼠40只，體重200～250 g。購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK桂2003-0003。實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食12 h，自由飲水。隨機(jī)分為手術(shù)組、生理鹽水組、抑制劑組和假手術(shù)組，每組10只。每天測(cè)量大鼠體重并觀察是否有縮足、舔足、跛行等行為學(xué)改變。

1.3 動(dòng)物模型的制備

手術(shù)組參考Kim等［6］方法建立大鼠腰5脊神經(jīng)結(jié)扎模型。用10%濃度0.3 mL/kg水合氯醛麻醉大鼠，以小鑷子夾大鼠后足無(wú)反應(yīng)為標(biāo)準(zhǔn)。大鼠取俯臥位，沿后正中線背部皮膚（L4～S1棘突水平）做縱向切口，長(zhǎng)度2～3 cm。在平雙側(cè)骼脊處鈍性分離肌肉和筋膜，直至觀察到第5腰錐橫突，用止血夾折斷橫突，避免損傷神經(jīng)，折斷后可觀察到腰4脊神經(jīng)和腰5脊神經(jīng)并行排列在下方。用眼科鑷分離腰4脊神經(jīng)和腰5脊神經(jīng)，手術(shù)縫線針折彎套上5-0絲線繞腰5脊神經(jīng)1周，結(jié)扎神經(jīng)。止血，逐層縫合皮膚與肌肉。保持無(wú)菌操作，避免術(shù)后感染。假手術(shù)組手術(shù)過程同上，但不結(jié)扎脊神經(jīng)。抑制劑組在造模前30 min，左手探及大鼠髖結(jié)節(jié)（平L5～6間隙）定位，右手持微量進(jìn)樣器于L5～6棘突間隙緩慢垂直進(jìn)針，出現(xiàn)甩尾反射后停止進(jìn)針，微量進(jìn)樣器緩慢注射4 μL抑制劑GSK'872（25 mmol/L）。生理鹽水組造模前30 min注入等量生理鹽水，與抑制劑組操作相同。

1.4 大鼠機(jī)械痛域（paw withdrawal threshold，PWT）值測(cè)定

造模后每天上午10時(shí)測(cè)量，室溫（23±1）℃。用von Frey filament進(jìn)行大鼠左后足底機(jī)械痛域測(cè)試，測(cè)量時(shí)以von Frey filament彎曲45°為標(biāo)準(zhǔn)，用up and down法檢測(cè)大鼠的機(jī)械痛域值。大于26g記為26 g。機(jī)械痛域值越低，表示機(jī)械性觸發(fā)痛越嚴(yán)重。

1.5 免疫組化法檢測(cè)脊髓組織RIP3的表達(dá)

造模后第8天，每組各取5只大鼠灌注，固定取材，大鼠僵硬后取脊髓和背根神經(jīng)節(jié)組織。標(biāo)本用4%多聚甲酵固定24 h，蔗糖脫水，進(jìn)行免疫組化染色。剩余大鼠斷頭取脊髓和背根神經(jīng)節(jié)，-80℃保存。泡過多聚甲醛的組織經(jīng)石蠟包埋，切片，烤片，脫蠟，脫水，抗原修復(fù)后，一抗（1∶200）4℃過夜后二抗室溫孵育10 min，DAB染色，蘇木素染核后在普通光鏡下觀察。分別對(duì)鏡下陽(yáng)性細(xì)胞的百分比和染色強(qiáng)度給予評(píng)分，陽(yáng)性細(xì)胞百分比：0計(jì)為0分，1%～25%計(jì)為1分，26%～50%計(jì)為2分，51%～75%計(jì)為3分，76%～100%計(jì)為4分；陽(yáng)性著色強(qiáng)度：無(wú)色計(jì)為0分，淡黃色計(jì)為1分，棕黃色計(jì)為2分，棕褐色計(jì)為3分。兩者計(jì)分相乘即為IRS評(píng)分等級(jí)：0～4分為低表達(dá)，5～12分為高表達(dá)。

1.6 Western blot檢測(cè)大鼠脊髓RIP3表達(dá)情況

用組織裂解液制備大鼠脊髓組織勻漿，4℃12 000 r/min離心5 min后取上清液，BSA法進(jìn)行蛋白定量。蛋白經(jīng)電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗（RIP3為1∶1 000；GAPDH 為 1∶2 000）4 ℃過夜，二抗（羊抗兔IgG 1∶2 000）室溫孵育 1 h，顯影，比較條帶灰度值。

1.7 ELISA檢測(cè)各組大鼠脊髓中TNF-α、IL-1β含量

取出保存的腰段脊髓，置于組織勻漿液，勻漿器4℃下勻漿，離心30 min，保留上清液，按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測(cè)TNF-α、IL-1β蛋白含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；對(duì)于重復(fù)測(cè)量的數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量方差分析比較組間是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義及各組間的變化趨勢(shì)。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠體重和行為學(xué)改變情況

4組大鼠術(shù)后7 d內(nèi)體重均增長(zhǎng)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 術(shù)后各組大鼠體重變化［（x±s），g］

2.2 各組大鼠PWT值測(cè)定

各組大鼠造模前機(jī)械痛域值均為26 g。造模后4組大鼠術(shù)后PWT值均下降，其中生理鹽水組前3 d PWT值下降后又上升，手術(shù)組、生理鹽水組與假手術(shù)組PWT值呈明顯下降趨勢(shì)（P＜0.05），但手術(shù)組與生理鹽水組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.499）；抑制劑組分別和假手術(shù)組、手術(shù)組相比PWT值下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。見表2。

2.3 免疫組化法檢測(cè)各組大鼠脊髓中RIP3的表達(dá)情況

手術(shù)組與生理鹽水組RIP3呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，抑制劑組和假手術(shù)組RIP3呈弱陽(yáng)性表達(dá)，且手術(shù)組和生理鹽水組IRS評(píng)分明顯高于抑制劑組和假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖 1。

2.4 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠脊髓中RIP3的表達(dá)情況

手術(shù)組、生理鹽水組、抑制劑組和假手術(shù)組RIP3表達(dá)水平（目的蛋白/內(nèi)參蛋白）依次為 0.90±0.16、0.89±0.20、0.49±0.15、0.15±0.05。手術(shù)組與生理鹽水組RIP3表達(dá)水平均高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.855，6.746，P＜0.001）；抑制劑組RIP3表達(dá)水平低于手術(shù)組與生理鹽水組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.855，6.746，P＜0.001）；生理鹽水組RIP3表達(dá)水平與手術(shù)組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.095，P=0.926）。見圖 2。

表2 術(shù)后各組大鼠PWT值變化［（x±s），g］

圖1 免疫組化法測(cè)定各組大鼠脊髓中RIP3的表達(dá)情況（HP染色，×100）

圖2 Western blot實(shí)驗(yàn)測(cè)定各組大鼠脊髓中RIP3的表達(dá)情況

2.5 ELISA檢測(cè)大鼠脊髓中TNF-α、IL-1β的含量

與假手術(shù)組比較，抑制劑組、生理鹽水組和手術(shù)組 TNF-α、IL-1β 含量均明顯升高（P＜0.05）；與抑制劑組比較，生理鹽水組和手術(shù)組TNF-α、IL-1β含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；而生理鹽水組與手術(shù)組TNF-α、IL-1β含量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 ELISA檢測(cè)各組大鼠脊髓中TNF-α、IL-1β的含量［（x±s），pg/mg］

3 討論

神經(jīng)病理性癌痛是癌痛的一種類型，據(jù)統(tǒng)計(jì)約30%的惡性腫瘤患者有神經(jīng)病理性癌痛［7］，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，因鎮(zhèn)痛不佳甚至可阻礙抗腫瘤治療計(jì)劃，但目前有關(guān)神經(jīng)病理性癌痛的臨床研究較少，如何有效控制神經(jīng)病理性癌痛成為亟需解決的難題。脊神經(jīng)結(jié)扎是神經(jīng)病理性疼痛研究中常見的一種模型，其結(jié)扎部位和強(qiáng)度變異性較小，操作簡(jiǎn)單，可出現(xiàn)較長(zhǎng)時(shí)間的機(jī)械痛敏和觸誘發(fā)痛［8］。本研究手術(shù)組、生理鹽水組、抑制劑組的機(jī)械痛域值均較假手術(shù)組高，提示采用腰5脊神經(jīng)結(jié)扎成功構(gòu)建了神經(jīng)病理性疼痛模型，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

RIP3蛋白是程序性壞死中的重要調(diào)控分子，但目前尚缺乏有關(guān)RIP3蛋白與神經(jīng)病理性疼痛的研究，本研究4組神經(jīng)病理性疼痛模型大鼠中，抑制劑組分別與假手術(shù)組和手術(shù)組相比機(jī)械痛域值均下降，表明RIP3表達(dá)量高的大鼠疼痛更明顯，而抑制RIP3表達(dá)疼痛減輕，提示RIP3可能在大鼠神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。

目前已有大量研究表明TNF-α、IL-1β在神經(jīng)病理性疼痛過程中起重要作用。姚偉偉等［9］給大鼠鞘內(nèi)注射TNF-α抑制劑，發(fā)現(xiàn)可改善大鼠脊神經(jīng)結(jié)扎誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛。Mei等［10］在小鼠腰5脊神經(jīng)結(jié)扎模型中發(fā)現(xiàn)鞘內(nèi)注射IL-1β中和抗體可減輕腰5脊神經(jīng)結(jié)扎引起的痛覺過敏。而有研究報(bào)道RIP3是調(diào)節(jié)促炎因子的關(guān)鍵蛋白，可特異性激活炎癥小體3，促進(jìn)Caspase-1活化，從而形成炎性體，導(dǎo)致炎癥因子 TNF-α、IL-1β 分泌［11］。在膿毒血癥實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭校?2］，RIP3基因缺失或提前給予Necrostatin-1均可避免由TNF誘導(dǎo)的全身炎癥性反應(yīng)。Moriwaki等［13］研究亦發(fā)現(xiàn)RIP3可對(duì)炎癥產(chǎn)生獨(dú)立作用。為進(jìn)一步研究RIP3與IL-1β、TNF-α等炎性因子在神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生機(jī)制中的作用，本研究采用ELISA進(jìn)一步檢測(cè)4組大鼠脊髓中IL-1β和TNF-α的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，生理鹽水組和手術(shù)組TNF-α、IL-1β含量較抑制劑組高，表明RIP3可能促進(jìn)了TNF-α、IL-1β分泌。分析原因認(rèn)為，當(dāng)結(jié)扎大鼠腰5脊神經(jīng)時(shí)神經(jīng)損傷，可能誘發(fā)RIP3表達(dá)增高，而RIP3蛋白通過RIP3-腫瘤壞死因子通路、RIP3-IFN通路、RIP3-LPS通路、RIP3-病原微生物通路等促進(jìn) TNF-α、IL-1β 炎性因子釋放［14］，導(dǎo)致了神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生。

綜上所述，本研究用脊神經(jīng)結(jié)扎的方法成功構(gòu)建了神經(jīng)病理性疼痛模型，發(fā)現(xiàn)RIP3表達(dá)增高的大鼠TNF-α、IL-1β釋放增多、疼痛行為更明顯；而抑制RIP3表達(dá)時(shí)TNF-α、IL-1β釋放減少、疼痛程度減輕，說明RIP3蛋白可能參與神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生。但本研究?jī)H在動(dòng)物模型中驗(yàn)證了RIP3、炎性因子與神經(jīng)病理性疼痛的關(guān)系，在大鼠體內(nèi)何種因素誘發(fā)RIP3增高，神經(jīng)病理性疼痛是否與程序性壞死有關(guān)，以及RIP3在人體內(nèi)是否發(fā)揮同樣作用，仍需一步研究。

［1］ Beggs S，Trang T，Salter MW.P2X4R+microglia drive neuropathic pain［J］.Nat Neurosci，2012，15（8）：1068-1073.

［2］ 李秋月，許海玉，楊洪軍，等.促炎因子 TNF-α，IL-1β，IL-6在神經(jīng)病理性疼痛中的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)中藥雜志，2017，42（19）：3709-3712.

［3］ Welz PS，Wullaert A，Vlantis K，et al.FADD prevents RIP3-mediated epithelial cell necrosis and chronic intestinal inflammation［J］.Nature，2011，477（7364）：330-334.

［4］ Gunther C，Martini E，Wittkopf N，et al.Caspase-8 regulates TNF-alpha-induced epithelial necroptosis and terminal ileitis［J］.Nature，2011，477（7364）：335-339.

［5］ He S，Wang L，Miao L，et al.Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha［J］.Cell，2009，137（6）：1100-1111.

［6］ Kim SH，Chung JM.An experimental model for peripheral neuropathy produced by segmental spinal nerve ligation in the rat［J］.Pain，1992，50（3）：355-363.

［7］ Bennett MI，Rayment C，Hjermstad M，et al.Prevalence and aetiology of neuropathic pain in cancer patients：a systematic review［J］.Pain，2012，153：359-365.

［8］ Hogan Q.Animal pain models［J］.Reg Anesth Pain Med，2002，27（4）：385-401.

［9］ 姚偉偉，周凱翔，王健，等.TNF-α抑制劑對(duì)神經(jīng)病理性痛大鼠鎮(zhèn)痛作用及其機(jī)制探討［J］.神經(jīng)解剖學(xué)雜志，2016，32（4）：423-428.

［10］Mei XP，Sakuma Y，Xie C，et al.Depressing interleukin-1beta contributed to the synergistic effects of tramadol and minocycline on spinal nerve ligation-induced neuropathic pain［J］.Neurosignals，2014，22（1）：30-42.

［11］Menu P，Vince JE.The NLRP3 inflammasome in health and disease：the good，the bad and the ugly［J］.Clin Exp Immunol，2011，166（1）：1-15.

［12］Duprez L，Takahashi N，Van Hauwermeiren F，et al.RIP kinase-dependent necrosis drives lethal systemic inflammatory response syndrome［J］.Immunity，2011，35（6）：908-918.

［13］Moriwaki K，Chan FK.RIP3：a molecular switch for necrosis and inflammation［J］.Genes Dev，2013，27（15）：1640-1649.

［14］于澤奇，衣泰龍，程世翔，等.受體相互作用蛋白3在炎癥中的作用［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2016，22（16）：3121-3124.