王堅(jiān)武 于祥遠(yuǎn) 王倩倩 秦林原 貝春華 譚盛葵， 何松青 唐博 廖維甲 余紅平

我國是肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）高發(fā)國家，每年全球約50%的HCC新發(fā)和死亡病例發(fā)生在我國［1］。HCC惡性程度高，早期檢出率低，患者確診時(shí)多屬中晚期，預(yù)后較差，但其病因尚未完全清楚，目前認(rèn)為HCC的發(fā)生是遺傳因素和環(huán)境因素相互作用的結(jié)果。乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）慢性感染是HCC最重要的危險(xiǎn)因素，但只有少部分慢性HBV感染人群最終發(fā)生HCC，提示機(jī)體的遺傳易感性在HCC發(fā)生中起重要作用［2-4］。

同源重組修復(fù)（homologous recombination repair，HRR）是一種重要的DNA修復(fù)機(jī)制，而RAD52是HRR通路的關(guān)鍵因子。研究表明，RAD52基因在胃癌、鼻咽癌等多種惡性腫瘤組織中異常表達(dá)，與腫瘤臨床分期、預(yù)后等關(guān)系密切［5-6］。微小RNA（miRNA）靶基因3'-UTR區(qū)域單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）可能影響miRNAs與靶基因序列結(jié)合，導(dǎo)致靶基因表達(dá)或功能改變。本研究應(yīng)用病例-對照研究方法，以1 002確診HCC新發(fā)病例和1 013非腫瘤患者為研究對象，探討RAD52基因3'-UTR區(qū)域miRNA靶序列SNPs與廣西地區(qū)人群HCC遺傳易感性的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本研究HCC患者為2007年1月至2011年4月在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院和廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院確診的新發(fā)患者，均經(jīng)病理組織學(xué)確診，調(diào)查前未行化療和（或）放療，共1 002例。同期收集來自上述醫(yī)院非腫瘤患者為對照組，均無腫瘤病史，在性別、年齡（±5歲）等與病例組匹配，共1 013例。采用統(tǒng)一調(diào)查問卷收集研究對象一般人口學(xué)特征和相關(guān)環(huán)境暴露因素資料，其中吸煙史和飲酒史定義如下：一生中連續(xù)或累積吸煙≥6個(gè)月，飲酒至少1次/周，且持續(xù)≥6個(gè)月。采集研究對象外周靜脈血液5 mL，提取外周全血基因組DNA，-80℃保存。本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象均知情同意。

1.2 SNPs位點(diǎn)選擇及基因分型

1.2.1 SNPs選擇 聯(lián)合應(yīng)用NIEHS（https：//www.niehs.nih.gov/）、mirSNP（http：//cmbi.bjmu.edu.cn/mirsnp）和NCBI dbSNP（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/snp）等數(shù)據(jù)庫，選擇RAD52基因3'-UTR區(qū)域miRNA靶序列SNPs，選擇標(biāo)準(zhǔn)：⑴依據(jù)HapMap數(shù)據(jù)庫中中國北京人群（HCB）最小等位基因頻率（MAF）大于0.05；⑵各SNPs之間連鎖不平衡系數(shù)（linkage disequilibrium，LD）r2小于 0.8。最終篩選到 rs1051669、rs1051672、rs7301931和rs7310449等 4個(gè) SNPs。

1.2.2 基因分型 利用Sequenom MassARRAY SNP分型系統(tǒng)對候選SNPs進(jìn)行基因型檢測，PCR擴(kuò)增反應(yīng)：按照反應(yīng)體系加入反應(yīng)成分10 ng/μL DNA 1 μL、10×Buffer 0.5 μL、25 mmol/L MgCl20.4 μL、5 U/μLTaq 0.2 μL、25 mmol/L dNTP 0.1 μL、20 μmol/L 特異擴(kuò)增引物混合液1 μL，去離子水補(bǔ)足至4 μL；反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性15 min，94℃變性20 s，56℃退火30 s，72℃ 延伸1 min，共45個(gè)循環(huán)，最后72℃終末延伸3 min。質(zhì)譜檢測：PCR產(chǎn)物經(jīng)蝦堿性磷酸酶（SAP）純化、單堿基延伸反應(yīng)、樹脂純化處理后，應(yīng)用SequenomMassARRAY系統(tǒng)，制備檢測用SpectroCHIP芯片，MALDI-TOF質(zhì)譜儀分析，獲取原始數(shù)據(jù)及基因分型圖，讀取結(jié)果?；蚍中蜋z測由北京博淼生物科技有限公司完成。對于SNP檢測結(jié)果，隨機(jī)抽取10%的樣本以盲法復(fù)測，具體做法：將病例組和對照組96孔樣品板分別按阿拉拍數(shù)字編號，各隨機(jī)抽取其中一個(gè)數(shù)字標(biāo)記的樣品板，進(jìn)行重復(fù)檢測，與前面檢測結(jié)果比對。所研究SNPs位點(diǎn)PCR擴(kuò)增引物序列信息見表1。

表1 RAD52基因多態(tài)位點(diǎn)引物序列信息

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。采用χ2擬合優(yōu)度檢驗(yàn)評估對照組各SNP基因型分布是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律；采用χ2檢驗(yàn)比較各分類變量和各SNP基因型頻率在病例組和對照組中的分布差異；采用多因素logistics回歸計(jì)算各位點(diǎn)基因型及其與環(huán)境因素的交互作用與HCC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的比值比（odds ratios，OR）及其95%置信區(qū)間（confidence intervals，CI）。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對象基本資料

病例組和對照組年齡、性別比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.45），但吸煙史、飲酒史及HBV感染等因素，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），見表2。

表2 病例組與對照組一般資料比較（x±s）

2.2 候選SNP基本信息

經(jīng)擬合優(yōu)度χ2檢驗(yàn)，本研究候選RAD52基因各SNPs位點(diǎn)（rs1051669C＞T、rs1051672G＞A、rs7301931T＞C和rs7310449 A＞G）基因型在對照組中的分布，均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，候選SNPs基本信息及分型結(jié)果見表3。

表3 候選SNPs位點(diǎn)信息及分型等位基因頻率分布

2.3 RAD52基因SNPs基因型與HCC遺傳易感性的關(guān)系

RAD52基因各SNP位點(diǎn)基因型在病例組和對照組中的分布頻率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。多因素Logistics回歸分析。調(diào)整年齡、性別、吸煙、飲酒和HBV感染等因素，未發(fā)現(xiàn)RAD52基因各SNP位點(diǎn)與HCC易感性存在統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)（P＞0.05），見表4。

2.4 RAD52基因SNPs位點(diǎn)與HCC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的分層分析

進(jìn)一步以年齡、性別、吸煙、飲酒及HBV感染等因素進(jìn)行分層分析，在隱性遺傳模型下，發(fā)現(xiàn)RAD52基因rs1051669和rs1051672位點(diǎn)與性別因素在HCC發(fā)病中存在交互作用（P＜0.05）：在女性人群中，與rs1051669位點(diǎn)C等位基因相比，TT基因型可顯著降低個(gè)體罹患 HCC的風(fēng)險(xiǎn) （TT vs CT/CC：OR=0.03，95%CI：0.00～0.62，P=0.03）；與 rs1051672 位點(diǎn)G等位基因相比，AA基因型可顯著降低個(gè)體罹患HCC的風(fēng)險(xiǎn)（AA vs GA/GG：OR=0.03，95%CI：0.01～0.88，P=0.04）。未發(fā)現(xiàn)其他SNPs位點(diǎn)與這些暴露因素有交互作用（P＞0.05）。見表5。

3 討論

表4 RAD52基因各SNPs基因型分布及其與HCC遺傳易感性的關(guān)系

RAD52基因作為HRR的關(guān)鍵因子，其在酵母的DNA雙鏈斷裂（double-strand break，DSB）修復(fù)、細(xì)胞減數(shù)分裂、有絲分裂重組及保持基因組穩(wěn)定性等細(xì)胞生物學(xué)過程中不可或缺，細(xì)胞中RAD52基因低表達(dá)或缺失將導(dǎo)致大范圍染色體變異，導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定［7］。功能學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在BRCA1、BRCA2或 PALB2基因缺陷細(xì)胞中，RAD52缺失能通過增加損傷誘導(dǎo)的染色體異常、降低HRR修復(fù)效率，縮短細(xì)胞生存期［6，8-9］。由此可見，RAD52 在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后過程中可能發(fā)揮重要作用。

表5 RAD52基因多態(tài)位點(diǎn)基因型與HCC發(fā)病關(guān)系的分層分析

基因3'-UTR具有miRNA的結(jié)合位點(diǎn)，是參與基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控的重要區(qū)域。研究表明，miRNA具有癌基因和抑癌基因樣作用，可能參與細(xì)胞發(fā)育、增殖、分化、凋亡等［10-11］。而miRNAs靶基因結(jié)合位點(diǎn)SNPs與HCC發(fā)生發(fā)展有關(guān)［12-13］。

Naccarati等［14］以捷克1 111例結(jié)直腸癌患者與1 469名健康對照者為研究對象，探討rs1051669位點(diǎn)與結(jié)直腸癌易感性的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，rs1051669 AA純合型個(gè)體罹患結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)明顯高于GG型個(gè)體（OR=1.68，95%CI：1.11～2.54）。但在中國人群中，發(fā)現(xiàn) rs1051669 與肺癌［15］、神經(jīng)膠質(zhì)瘤［16］等腫瘤的遺傳易感性顯著關(guān)聯(lián)。本研究亦未發(fā)現(xiàn)RAD52基因3'-UTR miRNA靶序列SNPs與HCC易感性的相關(guān)性。以年齡、性別、吸煙、飲酒、HBV感染等因素進(jìn)行分層分析，發(fā)現(xiàn)在女性人群中，與攜帶RAD52基因rs1051669位點(diǎn)C等位基因型者相比，TT基因型攜帶者罹患HCC的風(fēng)險(xiǎn)明顯降低；與攜帶rs1051672位點(diǎn)G等位基因型者相比，AA基因型攜帶者罹患HCC的風(fēng)險(xiǎn)亦明顯降低。據(jù)此推測，rs1051669與rs1051672位點(diǎn)可能影響廣西地區(qū)女性個(gè)體對HCC的易感性。

盡管本研究病例組和對照組的樣本量較大，但因某些SNP位點(diǎn)某種基因型在人群中分布頻率較低，致使該基因型個(gè)體頻數(shù)較小，可能對統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)效能產(chǎn)生一定影響。同時(shí)，本研究采用以醫(yī)院為基礎(chǔ)的病例對照研究，研究對象均來自醫(yī)院，亦可能存在一定程度的選擇偏倚。但本研究通過調(diào)查前統(tǒng)一培訓(xùn)調(diào)查人員、使用統(tǒng)一調(diào)查問卷、病例組與對照組在年齡（±5歲）、性別等方面匹配等措施盡可能減少偏倚。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在廣西地區(qū)女性人群中，RAD52基因3'-UTR區(qū)域miRNA結(jié)合位點(diǎn)rs1051669與rs1051672與HCC易感性可能有關(guān)，但仍需在大樣本人群中進(jìn)一步驗(yàn)證。

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