周業(yè) 張和良 劉重元 羅招陽 張志偉

摘 要：目的 探討LMP1羧基端功能活性區(qū)促進鼻咽癌干細胞SP18增殖作用機制。方法 采用生長曲線、平皿克隆形成實驗與軟瓊脂集落實驗分析LMP1TRADD對SP18細胞增殖的作用；運用Western-blot檢測SP18細胞中Wnt1、β-catenin與p-β-catenin蛋白的表達。結果 SP18-LMP1TRADD細胞的增殖能力較SP18-LMP1細胞減弱（P<0.01）；與SP18-LMP1細胞比較，SP18-LMP1TRADD細胞中Wnt1與β-catenin表達降低，而p-β-catenin蛋白表達增加（P<0.01）。結論 LMP1經(jīng)Wnt1/β-catenin途徑促進鼻咽癌干細胞SP18的增殖。

關鍵詞：鼻咽癌干細胞；LMP1；Wnt1/β-catenin通路；細胞增殖

中圖分類號：R318.0 文獻標識碼：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.07.024

文章編號：1006-1959（2018）07-0075-03

LMP1 through Wnt1/β-catenin Pathway to Promote the Proliferation of SP18 in Nasopharyngeal Carcinoma Stem Cells

ZHOU Ye，ZHANG He-liang，LIU Zhong-yuan，LUO Zhao-yang，ZHANG Zhi-wei

（ Key Laboratory of Tumor Cell and Molecular Pathology，Institute of Oncology，School of Medicine，South China University，Hengyang， 421001，Hunan，China）

Abstract：Objective To investigate the mechanism of the carboxyl-terminal functional active region of LMP1 in promoting proliferation of nasopharyngeal carcinoma SP18 stem cells.Methods Growth curve，plate colony formation assay and soft agar colony assay were used to analyze the effect of LMP1TRADD on the proliferation of SP18 cells.The expression of Wnt1，β -catenin and p-β-catenin in SP18 cells was detected by Western-blot.Results The proliferative ability of SP18-LMP1TRADD cells was lower than that of SP18-LMP1 cells（P<0.01），compared with SP18-LMP1 cells， the expression of Wnt1 and β-catenin in SP18-LMP1TRADD cells decreased，while the expression of p-β-catenin protein increased（P<0.01）.Conclusion LMP1 can promote the proliferation of SP18 in nasopharyngeal carcinoma stem cells via Wnt1/β-catenin pathway.

Key words：Nasopharyngeal carcinoma stem cells；LMP1；Wnt1/β-catenin pathway；Cell proliferation

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是我國廣東、廣西、湖南和香港等南方地區(qū)最常見的頭頸部惡性腫瘤。大量研究證實，EB病毒感染與NPC發(fā)病密切相關[1]。鼻咽癌干細胞在鼻咽癌轉移、復發(fā)、放療抵抗與耐藥的發(fā)揮重要作用。潛伏性膜蛋白1（latent membrane protein 1，LMP1）是EB病毒編碼的重要致瘤蛋白之一[2-4]。LMP1羧基末端包括三個功能活化區(qū)（carboxy terminal activating region，CTAR），即CTAR1、CTAR2和CTAR3[5-7]，其中CTAR2區(qū)域包含有腫瘤壞死因子受體相關死亡區(qū)（TRADD），是活性區(qū)重要的轉化位點[7-9]。然而，LMP1表達對鼻咽癌干細胞生長增殖的影響及分子機制仍不十分清楚。

1材料與方法

1.1細胞與質粒 鼻咽癌干細胞SP18由中山大學腫瘤研究所建立并惠贈，細胞培養(yǎng)采用低血清（2%～5%）血清（購自杭州四季青公司）的RPMI1640（Gibco BRL公司）培養(yǎng)。逆病毒質粒pLNSX-LMP1和pLNSX-LMP1TRADD（LMP1的CTAR2區(qū)域TRADD突變）[5-7]由中南大學腫瘤研究所構建并惠贈。

1.2細胞生長曲線 取2×103個SP18-LMP1和SP18-LMP1TRADD細胞接種于24孔板種中，每組均接種3個平行孔細胞，培養(yǎng)24 h后，每天2組取3孔細胞計數(shù)，重復計數(shù)3次，取均值為每組細胞數(shù)，連續(xù)計數(shù)細胞6 d，將所得不同時間計數(shù)細胞數(shù)連接后，繪制出細胞生長曲線。

1.3平板克隆形成實驗 分別取300個SP18-LMP1和SP18-LMP1TRADD細胞接種于24孔板中，每組均接種3個平行孔，將24孔板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周后，觀察細胞克隆形成情況，每孔加入1 ml甲醇進行細胞固定1 h后，加入0.5 ml的0.4%結晶紫染色15 min，肉眼計數(shù)細胞克隆，每孔重復計數(shù)3次，取3孔均值為每組克隆數(shù)，然后計算細胞克隆形成率，為形成克隆數(shù)比接種細胞數(shù)即為克隆形成率。

1.4軟瓊脂集落實驗 用瓊脂糖制備0.6%底層瓊脂，冷卻后用瓊脂糖及細胞制備0.3%頂層瓊脂（每孔含2×103個細胞）。實驗設SP18-LMP1和SP18-LMP1TRADD細胞組，每組3個平行孔，然后將24孔板置于37℃ 5% CO2溫箱內培養(yǎng)2周后。觀察集落形成情況并計數(shù)，其中細胞數(shù)大于50個細胞為1個集落，每孔重復計數(shù)3次，取3孔均值為每組集落數(shù)。計算細胞集落形成率為集落數(shù)比接種細胞數(shù)即為集落形成率。

1.5 Western-blot檢測蛋白表達 收集細胞，提取細胞總蛋白，以30 μg總蛋白/泳道，進行10% SDS不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉膜、封閉，一抗（1∶1000）室溫孵育濾膜1 h，洗膜，HRP標記二抗（1∶1000）室溫孵育濾膜1 h，洗膜后曝光、顯影、定影，分析結果。

1.6統(tǒng)計學處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計分析軟件進行分析，計量資料數(shù)據(jù)用（x±s）表示，兩組間均數(shù)比統(tǒng)計分析采用t檢驗，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1 LMP對SP18細胞生長的影響 將LMP1及LMP1TRADD導入SP18后，結果顯示，SP18-LMP1細胞生長速度明顯快于SP18-LMP1TRADD細胞的生長，說明LMP1可以促進SP18細胞的生長，而其CTAR2區(qū)域TRADD在促進SP18細胞生長中發(fā)揮重要作用（P<0.05），見圖1。

注：#SP18-LMP1 vs. SP18-LMP1TRADD，P<0.05

圖1 SP18-LMP1與SP18-LMP1TRADD細胞的生長曲線

2.2 LMP對SP18細胞增殖的影響 將LMP1及LMP1TRADD導入SP18后，結果顯示，SP18-LMP1形成的細胞克隆與集落數(shù)量及體積均大于SP18-LMP1TRADD細胞，同樣說明LMP1可以促進SP18細胞的增殖，而其CTAR2區(qū)域TRADD在促進SP18細胞增殖中發(fā)揮重要作用（n=3，P<0.05），見表1。

2.3 Western-blot檢測NF-кB P65蛋白的表達 為了解LMP1的CTAR2區(qū)域TRADD促進SP18細胞增殖的作用機制，采用Western-blot檢測LMP1對SP18細胞Wnt1通路的影響。結果顯示，SP18-LMP1細胞中Wnt1與β-catenin蛋白的表達較SP18-LMP1TRADD高，而p-β-catenin蛋白表達低，說明LMP1活化Wnt1/β-catenin通路，而CTAR2區(qū)域TRADD是通路活化的重要部位。

注：1：SP18-LMP1細胞；2：SP18-LMP1TRADD細胞

圖2 Western-blot檢測Wnt1、β-catenin與

p-β-catenin蛋白的表達

3討論

自Hamburger等[10]提出腫瘤干細胞（tumor stem cell，TSC）以來，不同組織來源的TSC不斷被分離，如乳腺癌[11]、肝癌[12]和肺癌[13]等。腫瘤組織TSC細胞數(shù)量少，其具有干細胞特性，被認為是惡性腫瘤發(fā)生和復發(fā)的根源。目前，鼻咽癌干細胞的生物學行為仍不清楚，其在NPC的作用及對轉移、復發(fā)、耐藥等的影響仍有待深入研究。EB病毒感染與NPC發(fā)生發(fā)展密切相關，在人體常潛伏感染，編碼多種潛伏蛋白[2-4]。其中LMP1是EB病毒基因組編碼促細胞癌變和轉移作用的重要致瘤蛋白[5-7]。

LMP1蛋白作為EB病毒編碼的重要致瘤蛋白，其在細胞功能的完成依賴于羧基端胞漿區(qū)的3個功能結構域，其中CTAR2（351～386aa）位于羧基端胞漿區(qū)末端，是羧基端重要的功能活性區(qū)域，能與TRADD蛋白結合，參與介導高水平NF- B及AP-1的活化[6-9]。本研究結果顯示，將LMP1導入SP18細胞后，CTAR2的TRADD活性區(qū)LMP1突變體促SP18生長及增殖能力均明顯低于野生型LMP1，說明LMP1-CTAR2的TRADD活性區(qū)參與了其促SP18細胞增殖的作用。

腫瘤干細胞中存在多條重要的信號途徑，其中Wnt/β-catenin途徑就是其中之一。細胞內Wnt途徑包括兩條，其一是決定細胞命運的經(jīng)典通路，其二是控制細胞運動與組織極性的非經(jīng)典通路[14]。Wnt經(jīng)典途徑參與細胞質內β-catenin穩(wěn)定、其進行核轉位，入核參與基因表達的調控。β-catenin游離于細胞質內并異常積聚，促進其入核。β-catenin量的蓄積、入核是Wnt/β-catenin信號途徑活化的關鍵[15]。Wnt1/β-catenin通路的活化在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中具有十分明顯的作用[16]。

本研究結果顯示，SP18-LMP1細胞中Wnt1與β-catenin蛋白的表達較SP18-LMP1TRADD高，而p-β-catenin蛋白表達低，說明LMP1促進SP18細胞中Wnt1與β-catenin蛋白表達，且使β-catenin磷酸化抑制，導致細胞漿中游離β-catenin含量增加且入核量也上升，從而激活Wnt-1/β-catenin途徑，從而發(fā)揮其促進SP18細胞增殖的作用，結果說明LMP1的CTAR2可能通過TRADD位點活化Wnt-1/β-catenin途徑促進SP18細胞增殖，但如何發(fā)揮調節(jié)功能有待后續(xù)深入研究。

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收稿日期：2017-11-22；修回日期：2017-11-23

編輯/楊倩