喬君 高翔 王瑜 梅仁彪

摘 要：目的 探討血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑纈沙坦對高血壓患者外周血單核細胞中IL-17表達的影響。方法 選取2016年9月～2017年10月在我院收治的原發(fā)性高血壓患者98例，將所有患者按照隨機數(shù)字表法分為纈沙坦組和硝苯地平組，各49例，纈沙坦組患者使用纈沙坦治療，硝苯地平組患者使用硝苯地平緩釋片治療，另選取健康體檢者20例為正常組。采集患者治療前及治療4周后靜脈血，分離PBMC體外培養(yǎng)5 h后用RT-PCR法測定IL-17 mRNA表達水平；培養(yǎng)上清液采用ELISA法測定IL-17濃度。結果 治療4周后纈沙坦組與硝苯地平組血壓變化比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；纈沙坦組治療后PBMC中IL-17 mRNA表達及培養(yǎng)上清液中IL-17濃度分別為（0.29±0.09），（76.16±20.56）pg/ml，低于硝苯地平組的（0.50±0.15），（137.84±39.97）pg/ml，組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論 纈沙坦可顯著降低高血壓患者PBMC中IL-17的表達，有助于延緩疾病發(fā)展。

關鍵詞：纈沙坦；高血壓；IL-17

中圖分類號：R544.1 文獻標識碼：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.07.021

文章編號：1006-1959（2018）07-0065-04

The Effect of Valsartan on the Expression of IL-17 in Peripheral PBMC of Patients with Essential Hypertension

QIAO Jun1，2，GAO Xiang3，WANG Yu1，MEI Ren-biao1

（1.Department of Medical Science and Research，Anhui University Of Science and Technology Medical College，Huainan 232001，Anhui，China；

2.Department of Laboratory，Huainan Second People's Hospital，Huainan 232072，Anhui，China；

3.Department of Internal Medicine，Huainan Second People's Hospital，Huainan 232072，Anhui，China）

Abstract：Objective To investigate the effect of valsartan， an angiotensinⅡreceptor blocker，on the expression of IL-17 in peripheral blood monocytes of patients with hypertension.Methods 98 patients with essential hypertension admitted in our hospital from September 2016 to October 2017 were randomly divided into valsartan group and nifedipine group（49 cases each）.Patients in valsartan group were treated with valsartan，nifedipine group was treated with nifedipine sustained release tablet，and 20 healthy cases were selected as normal group.Venous blood was collected before and after 4 weeks of treatment.The expression of IL-17 mRNA was measured by RT-PCR method after 5 h culture of PBMC in vitro，and the IL-17 concentration was measured by ELISA method in the supernatant of culture supernatant.Results After 4 weeks of treatment， there was no significant difference in blood pressure between valsartan group and nifedipine group，the difference was not statistically significant（P>0.05），the IL-17 mRNA expression in PBMC and the concentration of IL-17 in the culture supernatant of the valsartan group were（0.29±0.09），（76.16±20.56）pg/ml，respectively，lower than that of the nifedipine group（0.50±0.15），（137.84±39.97）pg/ml，the difference between the groups was statistically significant（P<0.05）.Conclusion Valsartan can significantly reduce the expression of IL-17 in the PBMCs of hypertensive patients and help to delay the development of the disease.

Key words：Valsartan；Hypertension；IL-17

原發(fā)性高血壓（essential hypertension，EH）是指以體循環(huán)動脈壓增高為特征的臨床綜合征。長期高血壓可影響心、腦、腎等重要器官的功能，最終導致這些器官功能衰竭，引發(fā)心絞痛、心肌梗死、心力衰竭、心源性猝死、腦卒中、腎小球硬化及腎實質纖維化等多種并發(fā)癥。目前研究證實高血壓與免疫紊亂具有相關性，白細胞介素17（interleukin-17，IL-17）是一種促炎細胞因子，在高血壓時通過多重作用，對高血壓的維持和發(fā)展起重要作用。血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑（angiotensin Ⅱ receptor blocker，ARB）可與血管緊張素Ⅱ1型受體（angiotensin II type 1 receptor，AT1R）結合從而拮抗血管緊張素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ）的升壓作用。鈣通道阻滯劑（calcium-channel blocker，CCB）主要通過阻斷心肌和血管平滑肌細胞膜上的鈣離子通道，抑制細胞外鈣離子內流，使細胞內鈣離子水平降低而引起心血管等組織器官功能改變。ARB和CCB都是治療高血壓的常用藥物。目前研究發(fā)現(xiàn)ARB在發(fā)揮降壓作用的同時，對機體的免疫系統(tǒng)也會產(chǎn)生影響。本研究旨在探究ARB與高血壓患者外周PBMC中IL-17蛋白及其mRNA表達是否存在關聯(lián)以及如何影響IL-17蛋白及其mRNA的表達。

1 材料與方法

1.1 材料 PBMC分離液（Solarbio），PMA（Mkbio），Ionomycin（Mkbio），RPMI-1640（Hyclone），逆轉錄試劑盒（Thermo scientific），Taq PCR Master Mix（上海生工），PCR引物（上海生工），IL-17A ELISA試劑盒（eBioscience），梯度PCR儀（Biometra Tgradient）， Multiskan Mk3型酶標儀（Thermo Fisher Scientific），VIW-2三恒電泳儀（浙江建德電表儀器廠），凝膠成像儀（Bio-Rad）。

1.2一般資料 2016年9月～2017年10月在淮南市第二人民醫(yī)院門診體檢正常者20例為正常組，門診或住院治療的原發(fā)性高血壓患者98例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。入組標準：①符合《國家基層高血壓防治管理指南2017》中的診斷標準；②年齡>18歲且<80歲；③所有受試對象均知曉本次研究并簽署知情同意書。排除標準：①各種繼發(fā)性高血壓患者；②自身免疫性疾病患者；③嚴重感染性疾病及血液病患者。根據(jù)隨機數(shù)字表法將98例原發(fā)性高血壓患者分為纈沙坦組和硝苯地平組，每組49例。纈沙坦組中，男26例，女23例，年齡36～77歲，平均年齡（65.32±7.65）歲；1級高血壓19例，2級高血壓25例，3級高血壓5例。硝苯地平組中男，25例，女24例，年齡37～76歲，平均年齡（65.98±7.15）歲；1級高血壓20例，2級高血壓23例，3級高血壓6例。正常組中，男11例，女9例，年齡39～75歲，平均年齡（62.32±6.62）歲。三組性別、年齡、高血壓分級比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），研究可進行。

1.3方法 患者入組前均未接受過降壓藥物治療或停用2周以上降壓藥物。纈沙坦組給予纈沙坦分散片（80 mg，皇隆制藥，H20050508）80 mg，1次/d，清晨口服；硝苯地平組給予硝苯地平緩釋片（Ⅰ）（10 mg，步長高新制藥，H61023583）10 mg，2 次/d；兩組患者療程均為4周。

1.3.1血壓的測量 清晨空腹安靜狀態(tài)下用水銀柱血壓計測量3次血壓，每次間隔1 min。3次讀數(shù)取平均值作為最終測量結果。

1.3.2 PBMC中IL-17 mRNA的檢測 治療前后清晨空腹用肝素真空采血管采集肘靜脈血3 ml，使用PBMC分離液分離PBMC，用RPMI 1640調整細胞濃度為2×106/ml。取細胞懸液300 μl加入12 μg/ml PMA工作液7.5 μl和50 μg/ml Ionomycin工作液6 μl，混勻，于5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)5 h。加入Trizol 1 ml，按照氯仿-異丙醇法提取總RNA，隨后按照逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA第一鏈。用Primer premier 6.0軟件設計IL-17 mRNA引物，以GAPDH mRNA為內參。引物序列如下：GAPDH上游引物5'-GCCACATCGCTCAGACA-3'，下游引物5'- CCTGCTTCACCACCTTCT-3'，產(chǎn)物長度812bp；IL-17上游引物5'-CAACCTGAACATCCATAACC-3'，下游引物5'-GTCGGCTCTCCATAGTCT-3'，產(chǎn)物長度380bp。PCR反應體系組成：Taq PCR Master mix 12.5 μl，cDNA模版2 μl，上游引物（10 μmol/L）1 μl，下游引物（10 μmol/L）1μl，RNase-Free ddH2O 8.5 μl， 混勻并短暫離心。PCR擴增參數(shù)為：預變性95 ℃ 5min，變性94 ℃ 30 s，退火55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，共35個循環(huán)，終末延伸72 ℃ 10 min。產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳30 min（100 V），使用凝膠成像儀拍照并測量IL-17 mRNA的相對表達量。

1.3.3培養(yǎng)上清液中IL-17濃度的檢測 上述培養(yǎng)液在加入Trizol前，先離心后收集部分上清液置-85 ℃冰箱冷凍保存。按照ELISA試劑盒使用說明書操作，使用酶標儀測量OD值并計算IL-17血漿濃度。

1.4統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析，試驗結果數(shù)據(jù)均以（x±s）表示，組間比較應用單因素方差分析（oneway，ANOVA），若方差齊者則采用LSD法比較兩組間差異，數(shù)據(jù)間相關性采用Pearson檢驗，當P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義，P<0.01表示統(tǒng)計學差異顯著。

2 結果

2.1兩組治療前后血壓的比較 兩組治療前收縮壓與舒張壓差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），治療后兩組收縮壓與舒張壓均顯著下降，但兩組間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表1。

2.2兩組治療前后IL-17 mRNA表達及IL-17濃度變化的比較 兩組治療前IL-17 mRNA表達及IL-17濃度差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。治療后，纈沙坦組IL-17 mRNA表達及IL-17濃度顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），硝苯地平組IL-17 mRNA表達及IL-17濃度下降不明顯，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表2。

2.3纈沙坦組IL-17 mRNA及IL-17表達水平與血壓水平的相關性分析 纈沙坦組高血壓患者經(jīng)治療后PBMC中IL-17 mRNA相對表達量的下降值與收縮壓的下降值進行線性相關統(tǒng)計學分析，相關系數(shù)r=0.854，雙側Pearson檢驗P<0.05，有統(tǒng)計學意義，見圖1。PBMC培養(yǎng)上清液中IL-17濃度下降值與收縮壓下降值進行線性相關統(tǒng)計學分析，相關系數(shù)r=0.798，雙側pearson檢驗P<0.05，有統(tǒng)計學意義，見圖2。

3 討論

目前研究證實高血壓的發(fā)生、發(fā)展中存在著低程度的炎癥反應與免疫紊亂。AngⅡ作為腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）中的循環(huán)激素在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮重要的調節(jié)作用，此外還可能作為組織RAS的成分發(fā)揮局部作用。生理水平的AngⅡ與屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族的AT1R結合，后者激活并促進細胞內信號級聯(lián)放大，最終發(fā)揮調節(jié)血壓和體液平衡的作用。AT1R的過度刺激可引起高血壓等疾病，在這一過程中血壓輕度升高可能引起輕微的組織損傷以及損傷相關分子模式和新抗原的形成，導致抗原提呈細胞活化、初始CD4+T細胞極化為炎性細胞，分泌多種炎性因子，結果使得組織器官損傷加重、血壓進一步升高。

ARB是治療高血壓的常用藥物之一，降壓作用明確且降壓效果與其他抗高血壓藥物相似，可單獨或與其他抗高血壓藥聯(lián)合使用。ARB是非肽類小分子量化合物，可與AngⅡ競爭性結合AT1R，從而阻斷AngⅡ的升壓作用，此外，ARB在減輕左心室肥厚、小動脈重塑[1]、大動脈硬化[2]方面的作用優(yōu)于其他抗高血壓藥物。目前研究發(fā)現(xiàn)ARB可通過影響動脈重塑及減少動脈壁纖維化而緩解血管硬化[3]，但具體機制仍不清楚。近期發(fā)現(xiàn)屬于ARB的纈沙坦可調節(jié)心臟水通道蛋白1和血管生成因子的表達而發(fā)揮心血管的保護作用[4]。

在涉及高血壓的炎性細胞中，Th17細胞發(fā)揮著重要作用。Th17細胞是一群獨特的CD4+細胞，因分泌IL-17而得名。IL-17具有強大的促炎作用，可促進其他炎性細胞因子、趨化因子的產(chǎn)生，并有促進纖維化作用[5]，此外還可調節(jié)腎鈉轉運，促進血管、腎臟的損傷及高血壓的維持[6]。那么ARB的治療作用與IL-17是否存在某種關聯(lián)呢？這就是我們此項研究的切入點。

我們在研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)纈沙坦治療之后患者血壓顯著下降，說明纈沙坦具有確切的抗高血壓作用。同時我們還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)纈沙坦治療之后患者外周PBMC中IL-17 mRNA表達顯著下調，培養(yǎng)上清液中IL-17濃度顯著下降，且下降值與血壓下降值存在顯著的正相關性。鑒于IL-17強大的促炎作用，其mRNA及蛋白表達的下調對于組織器官損傷的修復無疑是有益的，那么，纈沙坦對于改善血管內皮功能和減少血管及腎臟等器官纖維化的作用是不是通過或部分通過IL-17信號來實現(xiàn)的呢？這還有待于進一步研究。總之，纈沙坦可以有效地降低血壓并可降低外周PBMC中IL-17 mRNA表達以及IL-17濃度，有助于減輕或延緩高血壓并發(fā)癥的發(fā)生。

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收稿日期：2018-2-24；修回日期：2018-3-2

編輯/成森