李燕則 郭永清 衛(wèi)建峰 鄭李娜

[摘要]自噬是真核生物進(jìn)化上高度保守的一種物質(zhì)分解代謝途徑，主要用于分解和回收利用細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器、錯(cuò)誤折疊的長效大分子。但自噬的過度激活，對(duì)于機(jī)體來說卻是一種損傷機(jī)制。腦缺血再灌注損傷的損傷機(jī)制除與機(jī)體多種病理生理過程有關(guān)外，自噬也發(fā)揮了相當(dāng)重要的作用。自噬逐漸變成預(yù)防和治療人類多種重大疾病的靶點(diǎn)，其機(jī)制研究也變成研究焦點(diǎn)。本文旨在概括自噬的相關(guān)概念，研究自噬與腦缺血再灌注損傷的關(guān)系，介紹自噬發(fā)生的相關(guān)信號(hào)通路。

[關(guān)鍵詞]腦缺血再灌注損傷；自噬；信號(hào)通路；mTOR

[中圖分類號(hào)] R743 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2018）4（c）-0029-04

Progress autophagy mechanism and autophagy-related signaling pathways after cerebral ischemia-reperfusion injury

LI Yan-ze1 GUO Yong-qing2▲ WEI Jian-feng2 ZHENG Li-na2

1.Department of Anesthesiology，Shanxi Medical University，Shanxi Province，Taiyuan 030001，China；2.Department of Anesthesiology，Shanxi Provincial People′s Hospital，Shanxi Province，Taiyuan 030001，China

[Abstract]Autophagy is a highly conserved material decomposition and metabolism pathway in the evolution of eukaryotes，which allows the orderly degradation and recycling of intracellular damaged organelles or misfolded long-acting macromolecule.But hyperactivation of autophagy is an injury mechanism for the body.The injury mechanism of cerebral ischemia reperfusion injury is not only related to various pathophysiological processes，but also plays an important role in autophagy.Since autophagy has gradually become a target for the prevention and treatment of a variety of major diseases in human beings，its mechanisms arose increasing attention.This paper aims to summarize the related concepts about autophagy，study the relationship between autophagy and cerebral ischemia reperfusion injury as well as introduce the signaling pathways involved in autophagy.

[Key words]Cerebral ischemia reperfusion injury；Autophagy；Signal path；mTOR

世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù)表明，腦血管疾病是造成人類死亡的主要原因之一，因此，找到該種類型疾病正確的治療途徑有助于腦血管疾病工作的順利展開[1]。腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia reperfusion injury）是指腦組織因缺血導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)和功能的損害，但是有時(shí)缺血后再灌注不僅不能使結(jié)構(gòu)和功能恢復(fù)，反而加重其損害，其損害嚴(yán)重程度與缺血時(shí)間、需氧程度及殘余血流量有關(guān)，損傷區(qū)根據(jù)血流殘存的多少分為中心區(qū)和半暗帶區(qū)，中心區(qū)細(xì)胞死亡主要是細(xì)胞壞死，而半暗帶區(qū)主要是細(xì)胞凋亡和自噬。半暗帶區(qū)細(xì)胞仍有代謝活力，故對(duì)該區(qū)進(jìn)行抗缺血治療是阻止細(xì)胞惡化，減輕腦缺血再灌注損傷的重要手段。

1自噬的相關(guān)概念

人體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)主要靠物質(zhì)合成與分解代謝的正常進(jìn)行來維持。自噬是真核生物細(xì)胞一條重要的物質(zhì)分解代謝途徑，泛素蛋白酶體途徑是另一條重要途徑，二者的功能和結(jié)構(gòu)各有特點(diǎn)[2]。細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器、錯(cuò)誤折疊的高效大分子主要是通過自噬途徑分解，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的高效穩(wěn)定運(yùn)轉(zhuǎn)。依據(jù)底物與溶酶體結(jié)合方式的不同將自噬分為三類：巨自噬（macroautophagy）、微自噬（microautophagy）和分子伴侶介導(dǎo)的自噬（chaperone-mediated autophagy）。它們各有分工，在真核細(xì)胞中，巨自噬最容易發(fā)生，與腦缺血再灌注損傷的關(guān)系也最為密切。巨自噬的發(fā)生主要序貫性經(jīng)歷下面4個(gè)步驟：①誘導(dǎo)自噬發(fā)生；②形成自噬體；③自噬體與溶酶體膜的融合；④降解自噬體。微自噬指溶酶體膜內(nèi)陷包裹目標(biāo)靶物并被水解酶分解的過程[3]，而分子伴侶介導(dǎo)的自噬則指底物特定氨基酸序列（如KFERQ）在胞漿中的分子伴侶熱休克蛋白70（heat shock protein 70，HSC70）的介導(dǎo)下識(shí)別溶酶體膜上特異的受體溶酶體相關(guān)的膜蛋白2a（lysosome-associated membrane protein 2a，Lamp2a），使得底物與溶酶體結(jié)合，并由水解酶降解的過程[4]。

2自噬與腦缺血再灌注損傷

機(jī)體正常的自噬比較保守，其發(fā)生維持在適當(dāng)水平，主要用于清除胞內(nèi)受損的細(xì)胞器、錯(cuò)誤折疊的長效大分子等，以維持細(xì)胞高效穩(wěn)定的代謝需求[5]。然而，超過限度自噬并不能維持細(xì)胞穩(wěn)定，一定程度上會(huì)加劇損傷，促進(jìn)細(xì)胞死亡。該種細(xì)胞死亡是一種細(xì)胞程序性死亡，被稱為自噬性細(xì)胞死亡或Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡[6-8]。

Wang等[9]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠全腦缺血再灌注后30 min，透射電鏡下可見海馬自噬體及自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ形成，24～48 h仍舊維持在較高水平。腦缺血前30、60 min，在腦立體定位儀輔助下向側(cè)腦室內(nèi)靶向注射自噬抑制劑3-MA，發(fā)現(xiàn)海馬神經(jīng)細(xì)胞死亡抑制組織蛋白（cathepsin）B釋放減少和原位末端標(biāo)記（TUNEL）陽性細(xì)胞數(shù)量降低。可見，自噬參與腦缺血再灌注損傷，抑制自噬亦可顯著減輕神經(jīng)細(xì)胞缺血再灌注損傷。

3腦缺血再灌注損傷后自噬發(fā)生的相關(guān)信號(hào)通路

準(zhǔn)確高效的信號(hào)通路調(diào)節(jié)，使得細(xì)胞能夠應(yīng)對(duì)各種外界刺激并維持自身穩(wěn)定。TOR（target of rapamycin）是一種調(diào)控細(xì)胞周期、生長和增殖的絲氨酸/蘇氨酸激酶，是細(xì)胞自噬信號(hào)通路的一種調(diào)控蛋白，外界不良刺激引起的細(xì)胞因子的變化可被TOR感知，影響自噬的發(fā)生。發(fā)生細(xì)胞內(nèi)氧糖剝奪等，都可激活或抑制TOR活性，從而影響細(xì)胞自噬的發(fā)生[10]。

而在哺乳動(dòng)物中，主要存在正常處于活化狀態(tài)TOR的同源物哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）。mTOR可抑制自噬起始分子ULK1的活性，降低自噬的發(fā)生水平。TOR/mTOR能形成 TORC1/mTORC1和TORC2/mTORC2兩種復(fù)合物。mTORC1包括PRAS40（proline-rich akt substrate 40 kDa）、也稱為類G蛋白β亞基蛋白GβL（mLST8）、mTOR和Raptor（regulatory-associated protein of mTOR）。而雷帕霉素作用的主要靶點(diǎn)是Raptor[11]，雷帕霉素與其結(jié)合后，可抑制mTORC1的活性而誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。mTORC2包括mTOR、mSin1（mammalian stress-activated protein kinase-interacting protein 1）、Protor（protein observed with rictor）和Rictor（rapamycin insensitive companion of mTOR），而Rictor對(duì)雷帕霉素不敏感。蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）和蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）可以被mTORC2磷酸化，影響細(xì)胞骨架的形成[12]，但關(guān)于mTORC2和自噬的關(guān)系卻鮮有報(bào)道。

3.1 PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路

研究發(fā)現(xiàn)，磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/Akt/mTOR信號(hào)通路對(duì)自噬起著重要的調(diào)控作用，mTOR作為該通路中調(diào)控自噬的關(guān)鍵因子，它的活性是自噬體形成、成熟的關(guān)鍵[13-16]。

PI3K是一種具有蛋白激酶及磷脂激酶的雙重活性的蛋白，主要存在于細(xì)胞質(zhì)中。外界刺激引起細(xì)胞一系列變化信號(hào)，激活跨膜的酪氨酸激酶，從而招募PI3K的p85亞基，繼而P110亞基接收信號(hào)改變，激活PI3K[17]。PI3K可通過一系列信號(hào)傳遞激活A(yù)kt，通過下列途徑激活mTOR：一是直接激活mTOR；二是通過抑制TSC1 /TSC2復(fù)合物的形成，間接激活mTOR。

結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物（tuberous sclerosis complex，TSC）是mTOR上游可調(diào)節(jié)mTOR活性一種化學(xué)分子。TSC2被稱為GTP酶激活蛋白（GTPase-activating protein，GAP），可以通過激活GTP酶，使腦內(nèi)Ras同系物（ras homolog enriched in brain，Rheb）Rheb-GTP由活化型變成失活的Rheb-GDP[18]。活化型的Rheb-GTP能夠通過Raptor，激活mTORC1。Akt激活后，磷酸化TSC2，阻止TSC1/2復(fù)合物形成，進(jìn)而阻止Rheb-GTP失活，激活mTORC1，抑制自噬。Raf-1-MEK1/2-ERK1/2也可抑制TSC1/TSC2，最終激活Rheb-mTORC1，抑制細(xì)胞自噬的發(fā)生[19]。

這一信號(hào)通路調(diào)控受第十號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因（phosphatase and tensin homolog deleted from chromosome 10，PTEN）的負(fù)性調(diào)控，PTEN可以通過抑制PI3K的活性，誘導(dǎo)自噬的發(fā)生[17]。

細(xì)胞在穩(wěn)定狀態(tài)時(shí)，有活性的mTOR可以引起自噬蛋白Atg13高度磷酸化，從而降低Atg13和Atg的活性[20]，使其招募下游PI3K、LC3的能力下降，自噬體形成水平降低，故而降低自噬發(fā)生水平，從而達(dá)到精確調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝的目的。

3.2 AMPK-TSC1/2-mTOR信號(hào)通路

研究發(fā)現(xiàn)，p38 通路能夠誘導(dǎo)自噬的發(fā)生[21]。在缺血性腦疾病中，抑制p38可以抑制自噬，從而達(dá)到保護(hù)腦損傷的目的。

AMPK的另外一條通路ERK1/2也對(duì)自噬起正性調(diào)控作用。db/db小鼠中，ERK1/2活性下降或增強(qiáng)導(dǎo)致自噬和自噬相關(guān)蛋白Atg-7表達(dá)的減少或增加，進(jìn)而抑制或促進(jìn)自噬[22]。

AMPK可感知能量的變化，當(dāng)正常機(jī)體突然遭到應(yīng)激時(shí)，如缺血缺氧，三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）水平下降，即會(huì)激活A(yù)MPK，活化的AMPK可以抑制TSC2磷酸化，使Rheb-GTP失活，從而降低mTORC1的活性，激活自噬[23]。此外AMPK可通過DNA損傷反應(yīng)調(diào)節(jié)基因1（regulated indevelopment and DNA damage response 1，REDD1），增強(qiáng)或抑制TSC1/2的活性。在機(jī)體缺血缺氧時(shí)，AMPK可以誘導(dǎo)REDD1的表達(dá)，使得TSC2脫離其抑制性結(jié)合蛋白14-3-3，使得活化型Rheb-GTP變成失活Rheb-GDP，進(jìn)而促進(jìn)mTORC1失活[24]，促進(jìn)自噬發(fā)生。

3.3 P53途徑

p53亦參與調(diào)控細(xì)胞自噬。正常機(jī)體的p53含量較低，在細(xì)胞核中，通常與鼠雙小蛋白2（murine double minute 2，MDM2）結(jié)合成異二聚體，調(diào)控細(xì)胞的增殖分化。當(dāng)細(xì)胞受到外界各種突然刺激時(shí)，如缺血缺氧、氧化應(yīng)激、化學(xué)藥物等，都能引起細(xì)胞內(nèi)的蛋白激酶和NK（c-Jun amino-terminal kinase）磷酸化而激活p53。研究表明，p53在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中以不同調(diào)節(jié)方式調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬。在細(xì)胞核中，p53主要通過轉(zhuǎn)錄依賴性方式促進(jìn)細(xì)胞自噬的發(fā)生。而在細(xì)胞質(zhì)中的p53能以轉(zhuǎn)錄非依賴方式抑制自噬發(fā)生，主要是通過抑制AMPK活性和激活mTOR來實(shí)現(xiàn)的[25-26]。

在細(xì)胞中，p53亦可通過直接或間接激活mTOR上游一些調(diào)節(jié)因子而影響細(xì)胞自噬，這些因子主要包括PTEN（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome10）、AMPK、TSC2等。p53也可以直接反式激活TSC2，抑制mTOR的活性，上調(diào)細(xì)胞自噬。

p53在一定條件下可以激活蛋白激酶1（death-associated protein kinase1，DAPK1）以及促凋亡蛋白Bcl-2家族成員Bax、Bad、Bnip3和Puma等，這些因子可使自噬蛋白Beclin1與Bcl-2/Bcl-xL相互分離，而上調(diào)細(xì)胞自噬[27]?？梢?，p53可通過下調(diào)mTOR的活性或其他調(diào)節(jié)方式促進(jìn)細(xì)胞自噬發(fā)生。

4小結(jié)

綜上所述，隨著分子生物學(xué)中越來越多信號(hào)通路機(jī)制的不斷揭示，近些年來研究腦缺血再灌注損傷后自噬的相關(guān)信號(hào)通路作用機(jī)制的文獻(xiàn)也逐漸增多，但尚有未發(fā)現(xiàn)的信號(hào)通路。究竟通過何種措施在特定時(shí)機(jī)作用于相關(guān)信號(hào)通路，進(jìn)而通過減輕自噬而減輕腦缺血再灌注損傷程度，還需要大量實(shí)驗(yàn)與實(shí)踐來進(jìn)一步探索。本文所述mTOR作為調(diào)控自噬通路的關(guān)鍵蛋白，闡明其所在信號(hào)途徑及其作用，將對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)缺血再灌注腦損傷疾病提供至關(guān)重要的的治療方案。

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（收稿日期：2018-01-08 本文編輯：孟慶卿）