沈艷，沈鳳，閆海洋，徐殿琴，丁妍，譚玉潔，3( 貴州醫(yī)科大學(xué)，貴陽(yáng)550000； 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院；3 貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院)

宮頸癌的發(fā)生除與遺傳、環(huán)境、基因和人乳頭瘤病毒(HPV)感染，尤其是高危型HPV持續(xù)感染等因素有關(guān)外，還可能與表觀遺傳學(xué)改變有關(guān)[1]。甲基胞嘧啶雙加氧酶(TET)是由Tahiliani等[2]在研究存在t(10，11)(q22，q23)異位的白血病患者中作為融合蛋白發(fā)現(xiàn)的，包括TET1、TET2、TET3三名成員。其中TET1是最早被發(fā)現(xiàn)的，也是TET蛋白家族的主要成員之一。TET1是DNA去甲基化的重要基因，通過(guò)調(diào)節(jié)DNA上胞嘧啶和5-羥甲基胞嘧啶含量來(lái)改變基因組DNA的表觀遺傳學(xué)特征，繼而調(diào)控特定基因的表達(dá)[3]。在結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌等組織中TET1低表達(dá)[4～7]，提示TET1可能具有抑癌基因作用。前期研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織TET1表達(dá)與患者臨床病理分級(jí)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[8]。說(shuō)明TET1表達(dá)與宮頸癌發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，但其具體作用機(jī)制尚不清楚。目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)TET1與宮頸癌關(guān)系的研究較少。2016年6月～2017年11月，本研究構(gòu)建TET1過(guò)表達(dá)載體，并對(duì)穩(wěn)定過(guò)表達(dá)TET1的宮頸癌HeLa細(xì)胞進(jìn)行鑒定，旨在為進(jìn)一步研究TET1在宮頸癌中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 宮頸癌HeLa細(xì)胞，日本TaKaRa公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。帶氨芐抗性人pLVX-Tight-Puro-MYRF質(zhì)粒(簡(jiǎn)稱(chēng)pLVX-MYRF)，美國(guó)Invitrogen公司。主要試劑：LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑，美國(guó)Invitrogen公司；T4 DNA Ligase、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；SYBR Premix Ex Taq試劑盒，日本TaKaRa公司；DMEM培養(yǎng)基，美國(guó)Gibco公司；FBS，杭州四季青生物工程材料有限公司；0.25%胰酶，上海碧云天生物技術(shù)研究所；核酸內(nèi)切酶ClaⅠ、SpeⅠ，寶生物工程(大連)有限公司；2×Taq PCR master mix，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；PVDF膜，北京北方同正生物技術(shù)發(fā)展有限公司；5×蛋白上樣緩沖液(含DTT)，美國(guó)Roche公司；RIPA裂解液，北京索萊寶科技有限公司；TRIzol，美國(guó)Hyclone公司。主要儀器：凝膠成像儀、垂直電泳系統(tǒng)、半干電轉(zhuǎn)印系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司；普通PCR擴(kuò)增儀、核酸蛋白定量?jī)x，德國(guó)Eppendorf公司；超速低溫離心機(jī)，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 TET1過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定

1.2.1 引物設(shè)計(jì)合成 根據(jù)GenBank中提供的人FAM92A1-289序列(GenBank：DQ327716)及pLVX-MYRF載體圖譜，由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成引物：上游引物5′-CCGGAATTCATGATGAGGCGCACC-3′(含ClaⅠ酶切位點(diǎn))，下游引物5′-CCGCTCGAGTTACTTGTACAGCTCGT-3′(含SpeⅠ酶切位點(diǎn))。

1.2.2 目的片段擴(kuò)增 從人宮頸癌組織中提取總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，按PCR試劑盒說(shuō)明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系共20 μL：cDNA 2 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 6 μL，Mix(含Taq酶)10 μL；反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 90 s，共34個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 10 min。取PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，DNA純化回收試劑盒純化，- 20 ℃保存。

1.2.3 真核表達(dá)載體pLVX-MYRF-TET1構(gòu)建及鑒定 采用ClaⅠ、SpeⅠ酶分別對(duì)純化的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pLVX-MYRF載體雙酶切；酶切產(chǎn)物為帶有互補(bǔ)黏性末端的目的片段和載體，再次用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，DNA純化回收試劑盒切膠回收；將帶有互補(bǔ)黏性末端的TET1片段和pLVX-MYRF載體用T4 DNA Ligase 16 ℃過(guò)夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，得到真核表達(dá)載體pLVX-MYRF-TET1。經(jīng)42 ℃熱擊化后，涂于帶有氨芐青霉素抗性的LB平板上。次日提取細(xì)菌中的質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切及測(cè)序(上海生工生物工程有限公司)進(jìn)行鑒定，- 80 ℃保存。

1.3 穩(wěn)定過(guò)表達(dá)TET1的宮頸癌HeLa細(xì)胞鑒定

1.3.1 細(xì)胞分組處理 取宮頸癌HeLa細(xì)胞接種于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞融合至80%左右時(shí)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期生長(zhǎng)狀態(tài)良好細(xì)胞，0.05%胰蛋白酶消化、計(jì)數(shù)，接種于6孔板，每孔1×105個(gè)。將細(xì)胞隨機(jī)分為陰性對(duì)照組、TET1組，按脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pLVX-MYRF、重組質(zhì)粒pLVX-MYRF-TET1，轉(zhuǎn)染6 h更換新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.3.2 TET1 mRNA和蛋白表達(dá)檢測(cè) ①TET1 mRNA表達(dá)：采用Real-time PCR法。收集兩組轉(zhuǎn)染6 h再培養(yǎng)48 h細(xì)胞，采用TRIzol法抽提細(xì)胞總RNA，按RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，按SYBR Premix Ex Taq試劑盒說(shuō)明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系共50 μL：10×buffer(含Mg2+)5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，10 μmol/L上下游引物各2 μL，Taq 0.5 μL，ddH2O 36.5 μL；反應(yīng)條件：95 ℃ 15 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。②TET1蛋白表達(dá)：采用Western blotting法。收集兩組轉(zhuǎn)染6 h再培養(yǎng)48 h細(xì)胞，RIPA裂解液冰上裂解10 min，4 ℃條件下12 000 r/min離心30 min，留取上清液，BCA法蛋白定量。取部分蛋白加入1×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，100 ℃水浴或金屬浴5～10 min使蛋白充分變性。取變性蛋白15 μL行SDS-PAGE(10%分離膠、5%濃縮膠)，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用含5% BSA的TBST液封閉2 h，分別加入TET1、GAPDH一抗(稀釋倍數(shù)均為1∶1 500)，4 ℃孵育過(guò)夜；次日，TBST洗膜10 mim×3次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(稀釋倍數(shù)1∶2 000)，室溫下震蕩孵育1 h，TBST洗膜10 mim×3次，在暗室中化學(xué)發(fā)光、顯影、定影。采用Image J圖像處理軟件分析各蛋白電泳條帶的灰度值。以GAPDH為內(nèi)參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內(nèi)參蛋白電泳條帶灰度值的比值計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 TET1目的片段擴(kuò)增結(jié)果 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，在1 500 bp左右處出現(xiàn)與目的條帶大小一致的條帶。

2.2 重組質(zhì)粒的雙酶切及測(cè)序鑒定結(jié)果 雙酶切結(jié)果顯示，空質(zhì)粒只有一個(gè)7 000 bp大小的片段，重組質(zhì)粒則出現(xiàn)1 500、7 000 bp兩個(gè)片段。測(cè)序結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒中正確插入了TET1完整ORF(開(kāi)放閱讀框)片段。

2.3 兩組TET1 mRNA和蛋白表達(dá)比較 見(jiàn)表1。

表1 兩組TET1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

注：與陰性對(duì)照組比較，*P<0.05。

3 討論

DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)和基因組學(xué)研究的重要內(nèi)容[9]。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞中抑癌基因的高甲基化狀態(tài)可導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄失活，繼而導(dǎo)致腫瘤形成，而機(jī)體內(nèi)去甲基化物質(zhì)減少或缺失亦能引起腫瘤發(fā)生[10]。表明DNA甲基化狀態(tài)平衡是維持基因組穩(wěn)定的關(guān)鍵。

癌基因一直是腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn)。為了研究癌基因?qū)δ[瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響和分子發(fā)病機(jī)制，必須尋找到一種可攜帶目的基因的載體，以保證目的基因進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后可正常復(fù)制。因此，載體構(gòu)建是腫瘤學(xué)研究的最基本技術(shù)，也是實(shí)現(xiàn)對(duì)癌基因研究的第一步。目前認(rèn)為，質(zhì)粒是最理想的載體。故本研究選擇質(zhì)粒作為載體進(jìn)行研究。

TET1的主要作用是將5-甲基胞嘧啶轉(zhuǎn)化為5-羥甲基胞嘧啶，再轉(zhuǎn)化為5-羧基胞嘧啶及5-甲酰胞嘧啶，從而達(dá)到DNA去甲基化的目的[11，12]；還能使DNA甲基化介導(dǎo)的基因沉默重新激活。在胚胎干細(xì)胞和組織中5-羥甲基胞嘧啶表達(dá)豐富，但在腫瘤組織中表達(dá)明顯降低甚至缺失。TET1可促進(jìn)胚胎干細(xì)胞基因組CpG島去甲基化，調(diào)控DNA甲基化狀態(tài)，促進(jìn)胚胎干細(xì)胞多能性因子轉(zhuǎn)錄[13]，即具有自我更新和多向分化潛能。TET1對(duì)胚胎干細(xì)胞的自我更新能力和多能性潛力主要表現(xiàn)在對(duì)分化基因保持“沉默”，對(duì)多能性基因保持“激活”[14]。Pei等[15]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織TET1表達(dá)及5-羥甲基胞嘧啶水平明顯降低，TET1可直接與第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源基因(PTEN)的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，并通過(guò)CpG島的甲基化作用激活轉(zhuǎn)錄，抑制PTEN激活A(yù)KT和FAK通路，加快腫瘤生長(zhǎng)，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)PTEN啟動(dòng)子中CpG島的去甲基化作用提高5-羥甲基胞嘧啶含量，可使TET1抑制腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移；TET1通過(guò)DNA去甲基化效應(yīng)及Wnt信號(hào)通路上調(diào)金屬蛋白酶組織抑制因子2、3表達(dá)，繼而抑制腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲，而TET1缺失則可加速腫瘤細(xì)胞侵襲并促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[5]。以上研究提示，TET1高表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，而其低表達(dá)作用相反。

本研究首先對(duì)TET1目的片段進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在1 500 bp左右處出現(xiàn)與目的條帶大小一致的條帶，表明目的片段擴(kuò)增成功；將目的片段TET1與載體pLVX-MYRF進(jìn)行雙酶切后，用T4 DNA Ligase連接，構(gòu)建帶有氨芐青霉素抗性的真核表達(dá)載體pLVX-MYRF-TET1，雙酶切及測(cè)序鑒定結(jié)果顯示成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pLVX-MYRF-TET1。本研究采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將真核表達(dá)載體pLVX-MYRF-TET1和空質(zhì)粒pLVX-MYRF轉(zhuǎn)染宮頸癌HeLa細(xì)胞，Real-time PCR法和Western blotting法檢測(cè)結(jié)果顯示，TET1組TET1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯高于陰性對(duì)照組。證實(shí)目的片段TET1在宮頸癌HeLa細(xì)胞中成功過(guò)表達(dá)。本研究為進(jìn)一步探究TET1對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的影響奠定了重要基礎(chǔ)。

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