張然，孫德鵬，田洪蕓，宿書芳，劉艷明，劉月冉，劉偉，明雙喜，王駿*

1(山東省食品藥品檢驗研究院，山東 濟南， 250102) 2(山東大學，山東 濟南， 250012)

蜂蜜具有較高的營養(yǎng)價值和醫(yī)療保健功效，是世界范圍內(nèi)廣受推崇的傳統(tǒng)食品和農(nóng)產(chǎn)品。蜂蜜組成成分復雜，含有200種以上的化學成分，其中酚類物質(zhì)是含量僅次于糖類的重要組分[1]。蜂蜜中的酚類可進一步分為黃酮類物質(zhì)和酚酸類(又稱作非黃酮類)物質(zhì)，其含量影響蜂蜜的顏色、口感等主要感官指標，同時也是蜂蜜抗氧化性和清除自由基功效的主要活性成分[2-3]。蜂蜜中酚類物質(zhì)的含量受到氣候條件、土壤性質(zhì)、地理位置、蜜源植物種類等多種自然環(huán)境影響[4]，酚類物質(zhì)的分析與研究是原產(chǎn)地鑒別、蜂蜜指紋圖譜構建、真?zhèn)畏涿坭b別的重要依據(jù)[5-6]。本研究對以我國山東地區(qū)出產(chǎn)的洋槐蜜為研究對象，分析不同搖蜜時間，蜂蜜樣品中酚類物質(zhì)的含量，比較成熟蜜與未成熟蜜中酚類成分差異，結(jié)合數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析為洋槐蜂蜜成分研究、洋槐蜂蜜品質(zhì)評價提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

本研究在山東地區(qū)采用便利抽樣法抽取10個養(yǎng)蜂場(養(yǎng)蜂場最小間距>50 km)進行樣品采集。每個養(yǎng)蜂場采用隨機抽樣法抽取3個蜂箱，在2016年4至5月洋槐蜜收蜜季節(jié)，每個蜂箱分別于產(chǎn)蜜的3天、5天、8天、15天4個時間點現(xiàn)場收集相應的洋槐蜂蜜樣品(3天、5天、8天樣品視為未成熟蜜組，15天視為自然成熟蜜組)，樣品采集后立即放置4℃避光保存，共計收集到樣品120個。

1.2 酚類含量測定

根據(jù)文獻報道，本研究共選取了18種酚類物質(zhì)進行含量測定，包括11種黃酮類物質(zhì)和7種酚酸類物質(zhì)，同時，對蜂蜜中的水分、果糖和葡萄糖等3項基本品質(zhì)指標含量進行了測定(見表1)。水分、果糖和葡萄糖項目的測定采用《SN/T 0852—2012 進出口蜂蜜檢驗規(guī)程》、《GB/T 18932.22—2003 蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖含量的測定方法 液相色譜示差折光檢測法》標準規(guī)定的檢驗方法，黃酮類物質(zhì)、酚酸類物質(zhì)使用超高效液相色素譜質(zhì)譜聯(lián)用法進行測定，負離子電噴霧電離。

1.3 數(shù)據(jù)分析

測定完成后，對各項目的測定結(jié)果數(shù)據(jù)進行匯總整理，并進行統(tǒng)計分析，分析的主要內(nèi)容包括：對樣品中各酚類物質(zhì)含量進行描述性統(tǒng)計；對不同搖蜜時間的各組樣品進行比較，分析各酚類物質(zhì)在蜂蜜成熟過程中的含量變化；通過統(tǒng)計學方法檢驗成熟蜜樣品和未成熟蜜樣品中各酚類物質(zhì)含量是否存在顯著性差異。 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS 20.0和Excel完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 酚類含量測定結(jié)果

表1 測定項目列表Table 1 Test items

表2 測定結(jié)果 單位：μg/kg

注：*項目按照類別及15天及以上組的測定含量由大到小順序列出。

根據(jù)測定的結(jié)果(見表2)，18種酚類物質(zhì)中有表兒茶素、槲皮素、山奈酚、楊梅酮、兒茶精5個項目在全部樣品中均未檢出，均屬于黃酮類物質(zhì)；在檢出的酚類物質(zhì)中，成熟洋槐蜜中平均含量最高的為芹菜素(4 910.25 μg/kg)，平均含量較高的還有木犀草素(1 196.08 μg/kg)，其余酚類物質(zhì)的平均含量在12.26～154.55 μg/kg。

2.2 酚類物質(zhì)在蜂蜜成熟過程中的含量變化

對各酚類物質(zhì)變化情況進行分析，將標準化后的測定結(jié)果與搖蜜時間對應，可以發(fā)現(xiàn)13種酚類物質(zhì)的含量變化大致可分為3種趨勢：(1)芹菜素、咖啡酸對香豆酸、綠原酸、二甲氧基肉桂酸、阿魏酸、丁香酸、原兒茶酸等8種酚類物質(zhì)在產(chǎn)蜜期8天之前含量較低且趨于平穩(wěn)，8天之后含量迅速上升；(2)沒食子酸、蘆丁2種酚類物質(zhì)在采蜜期5天前含量較低，5～8天含量迅速上升，而8天以后上升趨勢放緩，含量趨于平穩(wěn)；(3)木犀草素、染料木素、柚皮素3種酚類物質(zhì)的含量隨著蜂蜜成熟過程總體呈下降趨勢，其中木犀草素在產(chǎn)蜜期初期含量下降迅速，而染料木素、柚皮素的下降速度相對平均。以蜂蜜中的果糖葡萄糖和水分含量變化作參照來看，酚類物質(zhì)的含量變化趨勢并非與水分的變化或糖類的積累完全同步。

2.3 成熟/未成熟洋槐蜜間酚類成分差異

排除表兒茶素等5個未檢出組分，應用單樣本Kolmogorov-Smirnov對其余測定結(jié)果數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，結(jié)果顯示各項目的p值均小于0.05，即數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，因此應用適用于非參數(shù)檢驗的秩和檢驗(Kruskal Wallis檢驗)對成熟蜜組和未成熟組的各項目差異進行分析[7]。根據(jù)秩和檢驗的結(jié)果，共有沒食子酸、咖啡酸等9種酚類物質(zhì)在成熟蜜/未成熟蜜中的含量呈現(xiàn)顯著性差異(p值<0.05)，同時果糖葡萄糖、水分2個基本品質(zhì)指標也呈現(xiàn)出顯著差異。

表3 秩和檢驗結(jié)果Table 3 The result of Kruskal Wallis test

注：*項目按照類別及p值由小到大順序列出，僅列出p值<0.05的項目。

3 結(jié)論

根據(jù)本研究中對120批洋槐樣品中18種酚類物質(zhì)測定的結(jié)果，山東地區(qū)的洋槐蜜含有芹菜素、木犀草素、咖啡酸、對香豆酸、綠原酸、沒食子酸、蘆丁、染料木素、二甲氧基肉桂酸、阿魏酸、柚皮素、丁香酸、原兒茶酸等13種酚類物質(zhì)，而不含表兒茶素、槲皮素、山奈酚、楊梅酮、兒茶精等5種酚類物質(zhì)，通過LC/MS/MS的測定，為蜂蜜特征鑒定和指紋圖譜的構建打下了基礎。

本研究對山東地區(qū)洋槐蜜中酚類物質(zhì)的含量變化進行了跟蹤研究，確證了多數(shù)酚類物質(zhì)的含量隨著蜂蜜的成熟而增加，但各物質(zhì)增加的趨勢不盡相同；而木犀草素、染料木素、柚皮素3種酚類物質(zhì)的含量隨著蜂蜜成熟過程總體呈下降趨勢，可能與氧化反應或酶的作用相關，具體的影響因素還需要進一步研究。

近年來，高品質(zhì)成熟蜜也成為許多蜂蜜生產(chǎn)企業(yè)宣傳的賣點，但在技術層面，并沒有公認的鑒別方法。本研究通過對比分析得到了沒食子酸、咖啡酸等9種在成熟蜜/未成熟蜜中呈現(xiàn)顯著含量差異的酚類物質(zhì)，可以作為區(qū)分成熟蜜和未成熟蜜的重要參考指標。

[1] 孫長波, 張晶.蜂蜜化學成分研究概況 [J].農(nóng)業(yè)與技術, 2014(8)：243-244.

[2] DA S P, GAUCHE C, GONZAGA L V, et al.Honey: Chemical composition, stability and authenticity [J].Food Chemistry, 2016, 196:309-323.

[3] 穆雪峰, 徐響, 孫麗萍,等.蜂蜜中酚類物質(zhì)及其抗氧化活性研究進展 [J].食品科學, 2011, 32(21): 278-282.

[4] TRUCHADO P, FERRERES F, BORTOLOTTI L, et al.Nectar Flavonol rhamnosides are floral markers of acacia (Robiniapseudacacia) honey [J].Journal of Agricultural & Food Chemistry, 2008, 56(19): 8 815-8 824.

[5] ESCRICHE I, KADAR M, JUANBORR S M, et al.Suitability of antioxidant capacity, flavonoids and phenolic acids for floral authentication of honey.Impact of industrial thermal treatment[J].Food Chemistry, 2014,142(2):135-143.

[6] 季文靜, 胡福良.蜂蜜中酚類化合物的分析研究進展 [J].蜜蜂雜志, 2007, 27(1):6-8.

[7] MCDONALD J H.Handbook of Biological Statistics [M].2nd ed.Baltimore: Sparky House Publishing, 2009.