鮑鏖天，裴少芬，唐杏燕，王曉霞，邵增瑯

(南京融點(diǎn)食品科技有限公司，江蘇 南京，211300)

速溶茶粉是以茶葉或茶鮮葉為主要原料，經(jīng)過(guò)萃取、過(guò)濾、濃縮和干燥等工藝制成的茶葉深加工產(chǎn)品，由于具有沖調(diào)速溶、易與其他食品調(diào)配等特點(diǎn)，近年來(lái)取得了高速發(fā)展[1]。

溫濕的茶園環(huán)境和較高的茶樹種植密度使得茶樹很容易滋生病蟲害，現(xiàn)階段以施用農(nóng)藥為主的防治措施又必然會(huì)帶來(lái)農(nóng)藥殘留問(wèn)題[2]。以茶葉為原料生產(chǎn)速溶茶粉的過(guò)程中還會(huì)發(fā)生農(nóng)藥殘留富集現(xiàn)象。以茶葉為參照，歐盟等主要進(jìn)口國(guó)對(duì)速溶茶粉中的農(nóng)藥最高殘留限量(maximum residue limit，MRL)要求非常嚴(yán)苛，我國(guó)最新修訂的國(guó)標(biāo)中也針對(duì)茶葉新增了多種農(nóng)藥檢測(cè)項(xiàng)目[3-4]。但是目前針對(duì)速溶茶粉中農(nóng)藥殘留檢測(cè)的報(bào)道非常少。

為了保證速溶茶粉的質(zhì)量安全和順利出口，必須建立起檢測(cè)速溶茶粉中農(nóng)藥殘留的方法。速溶茶粉中含有源于茶葉的多種成分(茶多酚、咖啡堿等)和加工過(guò)程中添加的多種輔料(檸檬酸、D-異抗壞血酸鈉等)，基質(zhì)成分相比茶葉更加復(fù)雜。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)的高選擇性、高靈敏度等特點(diǎn)使其適于檢測(cè)基質(zhì)成分復(fù)雜樣品中的痕量農(nóng)藥殘留[5]。QuEChERS(quick, easy, cheap, effective, rugged, safe)方法是一種簡(jiǎn)單、快速的樣品前處理技術(shù)，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留檢測(cè)[6]。2017年6月開始實(shí)施的GB 2763—2016針對(duì)茶葉增加了多項(xiàng)農(nóng)藥殘留檢測(cè)項(xiàng)目，其中克百威、內(nèi)吸磷、滅線磷、甲胺磷、辛硫磷、吡蚜酮、硫環(huán)磷、氯唑磷使用了LC-MS/MS方法進(jìn)行檢測(cè)[4]。本文采用QuEChERS方法對(duì)速溶茶粉進(jìn)行前處理，探索建立適合同時(shí)檢測(cè)速溶茶粉中這8種農(nóng)藥殘留的HPLC-MS/MS方法，以期實(shí)現(xiàn)對(duì)速溶茶粉中這8種農(nóng)藥殘留的準(zhǔn)確、快速檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

NaCl、MgSO4(AR級(jí))，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；MgSO4、N-丙基乙二胺(PSA)、石墨化碳黑(GCB)：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；乙腈、甲酸：LC-MS級(jí)，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；尼龍有機(jī)相微孔濾膜：0.22 μm，德國(guó)C&B公司。

克百威(carbofuran)、內(nèi)吸磷(demeton(o+s))、滅線磷(ethoprophos)、甲胺磷(methamidophos)、辛硫磷(phoxim)、吡蚜酮(pymetrozine)、硫環(huán)磷(phosfolan)和氯唑磷(isozofos)標(biāo)準(zhǔn)品：100 μg/mL，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204電子分析天平,梅特勒-托利多儀器上海有限公司；XW-80A旋渦混合儀,金壇希望科研儀器有限公司；RJ-TGL-1650臺(tái)式高速離心機(jī),無(wú)錫瑞江分析儀器有限公司；明澈TM-D 24UV超純水系統(tǒng),美國(guó)Merck Millipore公司；1260-6420液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀,美國(guó)Agilent公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源，正離子模式(ESI+)；干燥氣(氮?dú)?流速和溫度分別為10 L/min和350 ℃；霧化氣壓力為；毛細(xì)管電壓為3 500 V。

1.3.2 液相色譜條件

色譜柱：Poroshell 120 EC-C18色譜柱(2.7 μm，3.0 mm×50 mm)；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；流速：0.3 mL/min。

流動(dòng)相A：乙腈(含0.1%甲酸)；流動(dòng)相B：水(含0.1%甲酸)。

梯度洗脫程序：0～2 min，10% A；2～3 min，10%～60% A；3～10 min，60% A；10～11 min，60%～90% A；11～15 min，90% A；15～16 min，90%～10% A；16～20 min，10% A。

1.3.3 樣品前處理

稱取1 g(精確至0.01 g)樣品于50 mL離心管中，加入5 mL去離子水和10 mL乙腈，旋渦振蕩3 min，加入2.5 g NaCl，旋渦振蕩2 min，10 000 r/min離心5 min。

移取1 000 μL上層乙腈提取液加入到裝有150 mg MgSO4、50 mg PSA和50 mg GCB的2 mL離心管中，旋渦振蕩1 min，15 000 r/min離心5 min，移取200 μL凈化液至2 mL離心管中，加入800 μL超純水，旋渦振蕩1 min后過(guò)微孔濾膜備用。

1.3.4 溶液配制

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：分別移取100 μL 100 μg/mL農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中，用乙腈定容，配制成1 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。4 ℃下避光保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：移取100 μL混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于2 mL的離心管中，加入900 μL超純水，配制成100 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液；移取100 μL 100 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于2 mL離心管中，加入900 μL超純水，配制成10 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。

溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別移取200 μL乙腈于2 mL離心管中，再移取相應(yīng)濃度和體積的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于各離心管中，加水至1 mL，旋渦振蕩1 min后過(guò)微孔濾膜，配制成0.2、0.5、1、5、10和50 ng/mL溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作液。

基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別移取200 μL空白基質(zhì)凈化液(按1.3.3提取、凈化)于2 mL離心管中，再移取相應(yīng)濃度和體積的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于各離心管中，加水至1 mL，旋渦振蕩1 min后過(guò)微孔濾膜，配制成0.2、0.5、1、5、10和50 ng/mL基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

ESI+模式下，用全掃描、單離子監(jiān)測(cè)掃描和子離子掃描優(yōu)化各化合物母離子的碎裂電壓(fragmentor)和子離子的碰撞能(collision energy，CE)?？瞻谆|(zhì)進(jìn)樣，多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(multiple reaction monitoring，MRM)下發(fā)現(xiàn)，在滅線磷243.1>173.0的離子通道上存在基質(zhì)干擾，在其他離子通道上均沒(méi)有基質(zhì)干擾。參考BOTERO-COY等檢測(cè)土壤中草甘膦時(shí)遇到基質(zhì)干擾時(shí)的試驗(yàn)方法，雖然子離子173.0的響應(yīng)高于96.9的響應(yīng)，但選擇沒(méi)有基質(zhì)干擾的243.1>96.9作為滅線磷的定性離子對(duì)[7]。其他7種化合物均選擇響應(yīng)最高的2個(gè)子離子作為定量和定性離子。優(yōu)化后的質(zhì)譜MRM參數(shù)見表1。

表1 8種農(nóng)藥的MRM參數(shù)Table 1 The MRM parameters of the 8 kinds of pesticides

注：*為定量離子。

2.2 液相色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 流動(dòng)相的選擇

為了減小溶劑效應(yīng)，選擇與萃取溶劑相同的乙腈作為有機(jī)相[8]。ESI+模式下，在LC-MS/MS的流動(dòng)相加入揮發(fā)性的酸可以提供H+，從而提高目標(biāo)化合物的離子化效率[6]。綜合考慮色譜柱的pH耐受范圍和目標(biāo)化合物的離子化效率，分別在有機(jī)相和水相中加入0.1%的甲酸。

2.2.2 洗脫梯度的優(yōu)化

吡蚜酮的提取離子流圖(extracted ion current，EIC)如圖1所示。在1～2 min有機(jī)相比例為5%的條件下，吡蚜酮的峰型發(fā)生裂分，表現(xiàn)出很強(qiáng)的溶劑效應(yīng)[8-9]。將1～2 min有機(jī)相比例提高到10%，吡蚜酮峰型裂分現(xiàn)象消失，峰型良好。8種農(nóng)藥的總離子流圖(total ion current，TIC)如圖2所示。由圖2可知，2～3 min有機(jī)相比例快速提高到60%后并維持7 min，8種農(nóng)藥在10 min內(nèi)全部出峰且基本分離開。質(zhì)譜檢測(cè)與色譜檢測(cè)不同，不需要通過(guò)色譜將各目標(biāo)化合物完全分離，但保證目標(biāo)化合物具備一定分離度可以減小基質(zhì)與目標(biāo)化合物共流出的概率，從而減小目標(biāo)化合物離子化時(shí)的基質(zhì)干擾[10]。

圖1 吡蚜酮的提取離子流圖Fig.1 The EIC of the pymetrozine

圖2 8種農(nóng)藥的總離子流圖Fig.2 The TIC of the 8 kinds of pesticides

2.3 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.3.1 鹽的選擇

圖3 不同鹽對(duì)農(nóng)藥回收率的影響Fig.3 The influence of different salt on recoveries of pesticides

2.3.2 凈化劑的選擇

PSA可以顯著吸附茶葉中的茶多酚和葉綠素，GCB可以顯著吸附茶葉中的咖啡堿并凈化提取液的顏色[13]。在1.3.3的樣品前處理過(guò)程中分別加入150 mg MgSO4+50 mg PSA和150 mg MgSO4+50 mg PSA+50 mg GCB，試驗(yàn)重復(fù)3次[6]。各農(nóng)藥回收率試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。以MgSO4+PSA+GCB作為凈化劑時(shí)，吡蚜酮和辛硫磷的平均回收率分別只有37.7%和54.1%，而以MgSO4+PSA作凈化劑時(shí)，2種化合物的平均回收率分別為108.5%和92.3%。這可能是因?yàn)檫裂镣托亮蛄椎姆肿咏Y(jié)構(gòu)的平面化程度比較高(2種化合物均含有環(huán)狀平面結(jié)構(gòu))，凈化過(guò)程中對(duì)平面化合物具有吸附作用的平面層狀結(jié)構(gòu)的GCB吸附了這2種化合物[6]。綜合考慮8種農(nóng)藥的回收率，本文選擇使用MgSO4+PSA。

圖4 不同凈化劑對(duì)農(nóng)藥回收率的影響Fig.4 The influence of different adsorbent on recoveries of pesticides

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect，ME)嚴(yán)重影響LC-MS/MS分析的準(zhǔn)確性。KMELLR等用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率的差異(%)來(lái)衡量基質(zhì)效應(yīng)的強(qiáng)弱，ME>20%表明有比較強(qiáng)的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，ME<-20%表明有比較強(qiáng)的基質(zhì)抑制效應(yīng)[14]。

雖然本文通過(guò)凈化提取液、色譜分離和基質(zhì)稀釋等方法減弱了基質(zhì)效應(yīng)，但如表2所示，樣品中的吡蚜酮和甲胺磷仍然表現(xiàn)出較強(qiáng)的基質(zhì)抑制效應(yīng)。反相色譜分離時(shí)最初流出的主要是基質(zhì)中的極性成分，可能這些成分大幅降低了吡蚜酮和甲胺磷在ESI源中的離子化效率，造成了較強(qiáng)的基質(zhì)抑制效應(yīng)[15-16]。本文利用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)消除基質(zhì)效應(yīng)對(duì)定量分析的影響，以獲得更準(zhǔn)確的定量結(jié)果。

2.5 回收率和精密度

各農(nóng)藥的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線方程如表2所示。在LOQ～50 ng/mL范圍內(nèi)，8種農(nóng)藥的線性關(guān)系良好(R2均大于0.996)。

表2 農(nóng)藥的線性方程、相關(guān)系數(shù)(R2)、LOQs、線性范圍和METable 2 The linear equations, coefficients of determination (R2), LOQs， linear ranges and ME obtained for pesticides

在1 LOQ和4 LOQ兩個(gè)濃度添加水平下進(jìn)行8種農(nóng)藥的回收率和精密度試驗(yàn)，試驗(yàn)重復(fù)6次[17]?；厥章屎途芏仍囼?yàn)結(jié)果如表3所示。在2個(gè)濃度添加水平下吡蚜酮的平均回收率分別為61%和63%，回收率偏低。這可能是因?yàn)樗偃懿璺壑械囊恍┏煞謱?duì)吡蚜酮有吸附作用，造成乙腈萃取吡蚜酮的效率偏低。8種農(nóng)藥在2個(gè)濃度添加水平下的平均回收率均在61%～118%，RSD均在0.9%～10.5%，符合美國(guó)分析家化學(xué)協(xié)會(huì)(AOAC)對(duì)于農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留檢測(cè)分析的要求(回收率在50%～150%，RSD<15%)[6]。本方法的方法定量限小于或等于國(guó)標(biāo)和歐盟法令對(duì)茶葉及相關(guān)制品中這8種農(nóng)藥最大殘留限量的要求[18-21]。本方法可以滿足對(duì)速溶茶粉中這8種農(nóng)藥殘留檢測(cè)的要求。

2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定

表3 農(nóng)藥的回收率和精密度Table 3 The recoveries and RSDs of pesticides spiked atlow and high concentrations

應(yīng)用本方法檢測(cè)10個(gè)批次用低農(nóng)藥殘留茶葉生產(chǎn)的速溶茶粉和10個(gè)批次用普通茶葉生產(chǎn)的速溶茶粉。在10個(gè)批次的低農(nóng)速溶茶粉中均沒(méi)有檢出這8種農(nóng)藥殘留。在1個(gè)批次的普通速溶茶粉中檢出了0.032 mg/kg的甲胺磷殘留，雖然低于國(guó)標(biāo)和歐盟法令的要求(0.05 mg/kg和0.1 mg/kg)，但速溶茶粉中檢出高毒的禁用農(nóng)藥仍應(yīng)引起足夠的重視。

3 結(jié)論

本文研究建立了QuEChERS前處理結(jié)合HPLC-MS/MS技術(shù)快速檢測(cè)速溶茶粉中8種農(nóng)藥殘留的方法，系統(tǒng)優(yōu)化了方法中的質(zhì)譜、色譜和前處理?xiàng)l件。良好的線性關(guān)系、回收率和精密度等指標(biāo)表明本方法可以對(duì)速溶茶粉中的這8種農(nóng)藥殘留進(jìn)行準(zhǔn)確的定量檢測(cè)。同時(shí)本方法靈敏度高、快速、消耗的有機(jī)溶劑少，以本方法為基礎(chǔ)可以進(jìn)一步開發(fā)速溶茶粉中其他多種農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)的方法。

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