鄧斌， 黃宇， 趙凌， 皮光環(huán)

川崎病是一種病因不明，以全身彌漫性血管炎為主要病變的急性發(fā)熱出疹性疾病[1]。病理學(xué)證實(shí)，單核/巨噬細(xì)胞在川崎病急性期滲入冠狀動(dòng)脈壁內(nèi)外的炎癥細(xì)胞中占主導(dǎo)地位，受炎性細(xì)胞因子激活而進(jìn)一步遷移、浸潤，并引起一系列反應(yīng)，包括活性氧的產(chǎn)生[2]。研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激在伴有冠脈瘤的川崎病患者中增加，并且與動(dòng)脈內(nèi)膜中層增厚和硬化相關(guān)[3]。P22phox作為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶重要的亞單位，與其激活密切相關(guān)。P22phox活性的改變可影響體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生，在氧化應(yīng)激所致的炎癥中起著重要作用[4]。本研究采用RT-PCR技術(shù)初步觀察川崎病患兒治療前后和正常兒童外周血單核細(xì)胞中P22phox的變化及其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2015年10月至2016年6月川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒科收治住院的川崎病患兒40例，其中男24例，女16例；年齡0.5～6.5歲，平均年齡(2.75±1.04)歲；有冠脈損害者15例，無冠脈損害者25例。同期選擇本院小兒外科擇期手術(shù)患兒20例為正常組，其中男13例，女7例；年齡1.2～8.5歲，平均年齡(3.48±1.42)歲。兩組患兒在性別、年齡方面比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照2009年中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)制定的川崎病診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。川崎病合并冠狀動(dòng)脈病變的超聲診斷標(biāo)準(zhǔn)為[6]：(1)冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張的診斷標(biāo)準(zhǔn)：<3歲>2.5 mm，3～9歲>3 mm，>9～14歲>3.5 mm。(2)冠狀動(dòng)脈瘤的診斷標(biāo)準(zhǔn)：冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張內(nèi)徑大于正常1.5倍。小冠脈瘤：局部冠脈擴(kuò)張內(nèi)徑<4 mm。中等冠脈瘤：冠脈管腔內(nèi)徑4～8 mm，或≥5歲兒童，冠脈管腔內(nèi)徑介于正常冠脈內(nèi)徑的1.5～4倍。巨大冠脈瘤：冠脈管腔內(nèi)徑>8 mm，或≥5歲兒童冠脈管腔內(nèi)徑大于正常冠脈內(nèi)徑的4倍。

1.3 川崎病的治療 (1)人免疫球蛋白治療：于起病發(fā)熱的第7天，使用國際推薦人免疫球蛋白單次劑量2 g/kg，10～12 h內(nèi)靜脈輸入。(2)阿司匹林口服：采用日本推薦中等劑量即30～50 mg/(kg·d)，分2～3次，熱退3 d后逐漸減量，14 d后減至3～5 mg/(kg·d)，1個(gè)月后復(fù)查血常規(guī)、肝功、血沉、C反應(yīng)蛋白及超聲心動(dòng)圖，無異常者于發(fā)病后8～12周停藥，有冠脈病變者，需服用至冠狀動(dòng)脈內(nèi)徑恢復(fù)正常。

1.4 標(biāo)本收集 分別收集川崎病患兒入院當(dāng)天(發(fā)熱4～5 d，人免疫球蛋白治療前)、人免疫球蛋白治療3 d后和非感染對照組兒童靜脈血3 mL，置肝素抗凝管，2 000 r/min×10 min離心，吸取上層血漿置于-80 ℃冰箱凍存?zhèn)錂z。剩余加入等體積無菌磷酸鹽緩沖液，混勻后用淋巴細(xì)胞分離液(購自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司)密度梯度離心后分離外周血單核細(xì)胞。

1.5 外周血單核細(xì)胞中P22phox mRNA表達(dá)的檢測 采用TRIzol(天根生化科技有限公司)一步提取外周血單核細(xì)胞中的RNA，應(yīng)用紫外分光光度儀(GENEQUANT,UK)測定細(xì)胞總RNA的濃度和純度。

1.6 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 參照PrimeScriptTMRT reagent Kit說明書(TaKaRa公司，日本)，將10 μL已經(jīng)去除基因組的反應(yīng)液也加入10 μL反轉(zhuǎn)率反應(yīng)液中，總反應(yīng)體系為20 μL，42 ℃ 15 min合成cDNA，作為PCR 反應(yīng)的模板，于-20 ℃保存。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng) 使用SYBR Premix Ex Tap Ⅱ熒光染料和熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。P22phox引物及內(nèi)參序列由上海生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成。P22phox引物序列：上游：5′-CGA GCG GCA TCT ACC TAC TG-3′；下游：5′-GCT TGA TGG TGC CTC CGA T-3′；產(chǎn)物長度為99 bp。內(nèi)參GAPDH序列：上游：5′-CTG GGC TAC ACT GAG CAC C-3′；下游：5′-AAG TGG TCG TTG AGG GCA ATG-3′；產(chǎn)物長度101 bp。反應(yīng)體系為SYBR Premix Ex Tap Ⅱ 10 μL；P22phox引物各0.5 μL；GAPDH各0.5 μL；ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL；cDNA 2 μL；ddH2O 6.6 μL；總計(jì)20 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.8 擴(kuò)增曲線 所有基因在循環(huán)數(shù)內(nèi)達(dá)到平臺(tái)期，說明擴(kuò)增良好；融解曲線:單峰說明產(chǎn)物特異性好。

2 結(jié)果

2.1 定量結(jié)果 P22phox及GAPDH基因擴(kuò)增曲線起峰良好，基線穩(wěn)定。溶解曲線均呈單峰，無雜峰，說明無非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生，定量結(jié)果符合實(shí)驗(yàn)要求，見圖1(封三)。

2.2 川崎病患兒外周血單核細(xì)胞P22phox mRNA表達(dá)分析 川崎病組治療前后P22phox mRNA的表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；川崎病組治療前與正常組P22phox mRNA的表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；川崎病組治療后與正常組P22phox mRNA的表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 川崎病組治療前后及正常組P22phox mRNA表達(dá)的比較

注：與治療前比較，at=2.510，P<0.05；與正常組比較，bt=5.058，P<0.01。

2.3 治療前CALs、NCALs，治療前后CALs，治療后CALs、NCALs，治療前后NCALs各組P22phox mRNA表達(dá)分析 治療前CALs、NCALs P22phox mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療前后CALs P22phox mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療后CALs與NCALs P22phox mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療前后NCALs P22phox mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2(封三)。

3 討論

研究表明，氧化應(yīng)激參與川崎病急性期血管炎的發(fā)生，血管內(nèi)皮功能障礙及氧化應(yīng)激與后期的冠狀動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān)[7]。細(xì)胞色素b245(P22phox)是一種廣泛存在的蛋白質(zhì)，由位于染色體16q24上的CYBA基因編碼。作為煙酰胺脫氫酶/煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的一個(gè)亞單位，P22phox在傳遞電子及產(chǎn)生超氧陰離子方面起重要作用。其表達(dá)增加時(shí)NADPH氧化酶活性增加，進(jìn)而增加體內(nèi)活性氧水平，導(dǎo)致氧化還原信號(hào)改變，引起一系列功能紊亂。研究顯示，氧化應(yīng)激過程中產(chǎn)生的活性氧會(huì)損傷DNA，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，導(dǎo)致血管功能障礙[8]。以往研究顯示，血管內(nèi)皮損傷、血管彈力蛋白與血管壁結(jié)構(gòu)蛋白酶的降解、負(fù)向調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化可能與川崎病患兒冠脈損傷發(fā)生機(jī)制相關(guān)。成纖維細(xì)胞生長因子23、中性粒細(xì)胞表面黏附分子、白細(xì)胞介素1β、腫瘤壞死因子α等因子異常表達(dá)，核因子κB途徑等細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路的異常均可導(dǎo)致血管內(nèi)皮的免疫性損傷。

本研究結(jié)果表明，川崎病急性期治療前外周血單核細(xì)胞P22phox mRNA表達(dá)顯著高于治療后及正常組的表達(dá)，而治療后與正常組表達(dá)無差異，治療前有冠脈損害和無冠脈損害P22phox mRNA表達(dá)無差異，表明急性期外周血單核細(xì)胞P22phox mRNA存在高表達(dá)情況，提示氧化應(yīng)激可能參與川崎病急性期的發(fā)病機(jī)制。阿司匹林及人免疫球蛋白治療可使外周血單核細(xì)胞P22phox mRNA表達(dá)降低。川崎病急性期P22phox mRNA表達(dá)升高的機(jī)制目前尚不明確，國外學(xué)者研究表明核因子κB、白細(xì)胞介素1β均可上調(diào)P22phox的表達(dá)[9-10]，Yin等[11]研究發(fā)現(xiàn)川崎病患兒外周血單核細(xì)胞核因子κB活性顯著升高，是否急性期外周血單核細(xì)胞P22phox mRNA的高表達(dá)與核因子κB活性升高有關(guān)，亦或核因子κB是通過上調(diào)P22phox的表達(dá)而導(dǎo)致血管內(nèi)皮的免疫性損傷有待更進(jìn)一步的研究。研究顯示，阿司匹林可抑制環(huán)氧合酶1、環(huán)氧合酶2，進(jìn)而抑制血小板活化和炎癥反應(yīng)，可通過減輕氧化性低密度脂蛋白介導(dǎo)的損傷及增加內(nèi)皮細(xì)胞鐵蛋白表達(dá)而起抗氧化作用，可通過調(diào)節(jié)一氧化氮合成來改善血管舒縮活性，可通過抑制核因子κB的活化而在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控多種促炎因子的表達(dá)[12]。人免疫球蛋白能夠封閉單核/巨噬細(xì)胞壁上的FC受體，下調(diào)核因子κB活性，抑制單核細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子。因此推測阿司匹林及人免疫球蛋白可能是通過下調(diào)核因子κB活性導(dǎo)致P22phox下調(diào)，進(jìn)一步抑制活性氧的產(chǎn)生，是否阿司匹林及人免疫球蛋白還可通過影響其他P22phox調(diào)節(jié)因素來下調(diào)P22phox mRNA的表達(dá)有待進(jìn)一步研究。

值得關(guān)注的是，雖然整體上治療前外周血單核細(xì)胞P22phox mRNA表達(dá)高于治療后，但我們也發(fā)現(xiàn)40例川崎病患兒(15例冠脈損害，25例正常)中有9例患兒(4例冠脈損害，5例正常)的P22phox mRNA表達(dá)治療后高于治療前。眾所周知，阿司匹林及人免疫球蛋白治療后仍有少許患兒并發(fā)冠脈損害，國外研究顯示有川崎病病史的成年冠脈粥樣硬化患者存在全身性血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙及氧化應(yīng)激，認(rèn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙及氧化應(yīng)激是川崎病患者冠脈粥樣硬化早期發(fā)病的危險(xiǎn)因素之一[7]。P22phox編碼基因CYBA具有多態(tài)性，研究發(fā)現(xiàn)C242T、A640G、A930G基因多態(tài)性與氧化應(yīng)激所導(dǎo)致的心血管疾病相關(guān)[13-15]，是否本實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的治療后P22phox mRNA表達(dá)升高是實(shí)驗(yàn)誤差還是上述情況的可能機(jī)制有待于樣本量的進(jìn)一步擴(kuò)大以及對恢復(fù)期患兒的隨訪研究。

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