呂志飛，連戰(zhàn)，王如娜，馮昱寧，陳靜*，劉新利

(1.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)生物工程學(xué)院，濟(jì)南 250353；2.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)山東微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250353)

金黃色葡萄球菌是人類的一種重要病原菌，是食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的絕大多數(shù)食品的必檢指標(biāo)。乳酸鏈球菌素是我國(guó)《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中允許在食品中使用的微生物源防腐劑，但是乳酸鏈球菌素僅抑制引起食品腐敗的多種革蘭氏陽性菌，一般對(duì)革蘭氏陰性菌、霉菌、酵母菌沒有抑制效果。因此，若將乳酸鏈球菌素與抗真菌的物質(zhì)聯(lián)合使用，可以抑制食品中的有害細(xì)菌和真菌。

槐糖脂是一類由非致病性酵母菌產(chǎn)生的糖脂類生物表面活性劑，具有無毒、生物可降解、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，在環(huán)境保護(hù)、洗滌劑及醫(yī)藥等方面展示了良好的應(yīng)用前景[1-8]。近年來，對(duì)槐糖脂藥物活性的研究已有許多文獻(xiàn)報(bào)道，其中包括了槐糖脂的抗菌作用[9-14]。Kim等報(bào)道30 μg/mL的槐糖脂作用于大腸桿菌時(shí)，可使致病性大腸桿菌全部死亡。董永勝等報(bào)道了槐糖脂對(duì)植物源致病真菌有良好的抑制效果[15]。伏圣秘等報(bào)道了槐糖脂對(duì)水稻紋枯菌、水稻稻瘟菌和馬鈴薯晚疫病菌孢子的萌發(fā)、菌絲的生長(zhǎng)都有明顯抑制作用[16]。Joshi-Navare等報(bào)道了當(dāng)槐糖脂和抗生素聯(lián)合使用時(shí)，槐糖脂能夠增強(qiáng)抗生素對(duì)細(xì)菌的作用[17]。

但是，槐糖脂與乳酸鏈球菌素聯(lián)合使用對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用目前未見報(bào)道。本文首先研究并比較了內(nèi)酯型槐糖脂、乳酸鏈球菌素單獨(dú)使用對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用與藥物濃度、作用時(shí)間的關(guān)系；然后進(jìn)一步研究了兩者聯(lián)合抑制金黃色葡萄球菌的效果。本研究為探討槐糖脂作為新型微生物源食品防腐劑以及能否與乳酸鏈球菌素聯(lián)合應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

槐糖脂生產(chǎn)菌株：假絲酵母(CandidabombicolaATCC 22214)。

抑菌實(shí)驗(yàn)指示菌：金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，山東省工業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.2 藥物

內(nèi)酯型槐糖脂：本實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵制備，其主要結(jié)構(gòu)見圖1。乳酸鏈球菌素：山東元泰生物工程有限公司。

圖1 內(nèi)酯型槐糖脂分子結(jié)構(gòu)

1.3 方法

1.3.1 藥物溶液的配制

1.3.1.1 內(nèi)酯型槐糖脂溶液

稱取一定質(zhì)量的內(nèi)酯型槐糖脂加到蒸餾水中，反復(fù)震蕩并用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6～7之間，使內(nèi)酯型槐糖脂完全溶解，分別配制成槐糖脂濃度為10 mg/mL和1024 μg/mL的內(nèi)酯型槐糖脂藥物母液，并過濾除菌，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要稀釋至相應(yīng)濃度。

1.3.1.2 乳酸鏈球菌素溶液

稱取一定質(zhì)量的乳酸鏈球菌素于紫外燈下15 min后加到無菌水中，反復(fù)震蕩至其完全溶解，分別配制成乳酸鏈球菌素濃度為10 mg/mL和1024 μg/mL的乳酸鏈球菌素藥物母液。

1.3.2 金黃色葡萄球菌菌懸液的制備

挑取LB平板上的金黃色葡萄球菌單菌落接種于100 mL LB液體培養(yǎng)基中，35 ℃，150 r/min培養(yǎng)6 h。取一定體積的菌液用生理鹽水稀釋至細(xì)胞濃度為108cfu/mL，為金黃色葡萄球菌菌懸液。

1.3.3 藥物對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑的測(cè)定

用管碟法定性測(cè)定藥物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制活性。

首先，用移液槍移取100 μL菌濃為108cfu/mL的菌懸液均勻涂布于LB平板上，再用無菌鑷子夾取滅菌后的牛津杯置于涂有菌懸液的平板上，牛津杯中注入50 μL濃度分別為2.5，5，7.5，10 mg/mL的藥物溶液。小心地將平板置于4 ℃的冰箱中使藥物擴(kuò)散2 h，然后置于35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑。

1.3.4 藥物對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)

最小抑菌濃度是指微生物在特定生長(zhǎng)環(huán)境下培養(yǎng)一定的時(shí)間，可抑制某種微生物明顯增長(zhǎng)的最低藥物的濃度，用于定量測(cè)定體外的抗菌活性。采用美國(guó)臨床委員會(huì)(CLSI)推薦的M7-A7標(biāo)準(zhǔn)方法試管二倍稀釋法，再略加修改后進(jìn)行測(cè)定，具體步驟如下：

首先，取13 mm×100 mm試管24支，每排12支，共2排，每排分別標(biāo)記為1～12號(hào)。其中1～10號(hào)是藥物組，11號(hào)是空白對(duì)照組，12號(hào)是金黃色葡萄球菌陽性對(duì)照組。除第1支試管外，其余試管內(nèi)均加入LB培養(yǎng)基2 mL。分別用LB培養(yǎng)基稀釋槐糖脂母液、乳酸鏈球菌素母液，稀釋至最高濃度分別為256，8 μg/mL。然后在第1支和第2支試管中分別加入稀釋好的藥液2 mL，第2支試管混勻后吸出2 mL加到第3支試管中，依次對(duì)倍稀釋至第10支試管，吸出2 mL棄去。這樣第1排各管內(nèi)酯型槐糖脂的最終濃度依次為256，128，64，32，16，8，4，2，1，0.5 μg/mL，第2排各管乳酸鏈球菌素的最終濃度依次為8，4，2，1，0.5，0.25，0.12，0.06，0.03，0.015 μg/mL。用LB液體培養(yǎng)基按照1∶10的比例稀釋菌懸液(含菌量約107cfu/mL)。用移液槍準(zhǔn)確移取0.1 mL金黃色葡萄球菌菌懸液依次由低濃度到高濃度加到2排1～10，12號(hào)試管中，最終接種菌量約為5×105cfu/mL。用移液槍分別準(zhǔn)確移取0.1 mL LB液體培養(yǎng)基加到2排第11號(hào)試管中。35 ℃下培養(yǎng)24 h后閱讀結(jié)果，抑制檢測(cè)菌肉眼可見生長(zhǎng)的最低藥物濃度為該藥對(duì)檢測(cè)菌的MIC。

1.3.5 藥物對(duì)金黃色葡萄球菌的最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration，MBC)

含菌量為107cfu/mL的金黃色葡萄球菌菌懸液用LB培養(yǎng)基以1∶10的方式連續(xù)稀釋4次，最后稀釋管的含菌量約為103cfu/mL。然后分別取0.1 mL加到3個(gè)LB平板上，用涂布器均勻涂布，35 ℃培養(yǎng)24 h后對(duì)平板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)并計(jì)算其平均數(shù)N，然后計(jì)算菌落數(shù)I(I代表0.1% 最初接種菌量的菌落數(shù))，見下式：

I=N2+2N2。

將1.3.4中金黃色葡萄球菌培養(yǎng)20 h后將無肉眼可見生長(zhǎng)的各試管混勻15 s后再培養(yǎng)4 h，再次混勻后從無肉眼可見生長(zhǎng)的各試管中分別取0.1 mL加到LB平板中，用涂布器均勻涂布，35 ℃培養(yǎng)24 h后，對(duì)每個(gè)平板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)并計(jì)算其平均值。菌落計(jì)數(shù) ≤0.1%最初接種菌量的最低藥物濃度為該藥對(duì)檢測(cè)菌的最低(或最小)殺菌濃度。

1.3.6 藥物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌動(dòng)力學(xué)

采用液體培養(yǎng)抑制測(cè)定法略做修改。在菌濃為5×105cfu/mL的金黃色葡萄球菌菌懸液中分別加入一定量的內(nèi)酯型槐糖脂和乳酸鏈球菌素，使其終濃度為各自的MIC。35 ℃，150 r/min搖床培養(yǎng)不同時(shí)間后用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定600 nm處的吸光度A。以蒸餾水為對(duì)照組。按Hultmark等的方法計(jì)算抗菌活力，見下式：

U=A0-AA0。

式中：A0為初始吸光度；A為不同時(shí)間的吸光度。

1.3.7 藥物相互作用的研究

根據(jù)單藥抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按微量棋盤稀釋法略做改良進(jìn)行測(cè)定，具體步驟如下：

首先，在5 mL離心管內(nèi)將內(nèi)酯型槐糖脂原液和乳酸鏈球菌素原液分別用LB液體培養(yǎng)基稀釋至256，4 μg/mL，再分別依次對(duì)倍稀釋6個(gè)濃度梯度。然后按照“棋盤”稀釋法原則組合在無菌的96孔板中加入內(nèi)酯型槐糖脂和乳酸鏈球菌素各50 μL。用LB液體培養(yǎng)基稀釋菌懸液為106cfu/mL，每孔接種100 μL。使2種藥物的最終濃度與計(jì)劃稀釋度相同，最終接種菌量為5×105cfu/mL。將96孔板置于微型振蕩器上振蕩1 min，使各孔內(nèi)溶液混勻，96孔板用封口膜密封以減少培養(yǎng)過程中的水分蒸發(fā)。35 ℃下培養(yǎng)20 h后，在每孔中加入顯色劑5 μL(5 g/L氯化三苯四氮唑)，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，將96孔板放在白色背景下觀察，孔內(nèi)液體呈紅色表示菌體生長(zhǎng)，孔內(nèi)液體呈LB液體培養(yǎng)基的顏色表示菌體生長(zhǎng)被抑制。

分級(jí)抑菌濃度指數(shù)(fractional inhibitory concentration, FIC)為抗菌藥物藥效學(xué)參數(shù)之一，是2種抗菌藥的聯(lián)合藥效(2種抗菌藥同時(shí)使用時(shí)，可出現(xiàn)協(xié)同、相加、無關(guān)和拮抗4種情況)指標(biāo)。

FIC=(A藥聯(lián)用時(shí)的MIC/A藥單用時(shí)的MIC)+(B藥聯(lián)用時(shí)的MIC/B藥單用時(shí)的MIC)。

FIC≤0.5，是協(xié)同作用；0.52，是拮抗作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑

內(nèi)酯型槐糖脂和乳酸鏈球菌素對(duì)金黃色葡萄球菌均有較強(qiáng)的抑制作用，且抑菌圈直徑隨著2種藥物濃度的增加而增大，最大抑菌圈直徑分別為10.50，21.30 mm，呈濃度依賴性。乳酸鏈球菌素對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用明顯強(qiáng)于內(nèi)酯型槐糖脂對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用。同一藥物濃度下，乳酸鏈球菌素對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑大約是內(nèi)酯型槐糖脂對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑的2倍，見圖2和表1。

圖2 藥物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑

注：a為空白對(duì)照，b為內(nèi)酯型槐糖脂，C為乳酸鏈球菌素。

表1 藥物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑(N=4)

2.2 藥物對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度

圖3 藥物對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度

注：S為內(nèi)酯型槐糖脂，L-SLs；N為乳酸鏈球菌素，Nisin。

圖3中S是內(nèi)酯型槐糖脂對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度實(shí)驗(yàn)結(jié)果。由圖3中S可知，1～4號(hào)試管澄清，5～10號(hào)試管渾濁，11號(hào)試管澄清，12號(hào)試管渾濁。因此，抑制金黃色葡萄球菌肉眼可見生長(zhǎng)的最低藥物濃度為4號(hào)試管對(duì)應(yīng)的內(nèi)酯型槐糖脂濃度，即32 μg/mL。所以，內(nèi)酯型槐糖脂對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC值為32 μg/mL。

圖3中N是乳酸鏈球菌素對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度實(shí)驗(yàn)結(jié)果。由圖3中N可知，1～5號(hào)試管澄清，6～10號(hào)試管渾濁，11號(hào)試管澄清，12號(hào)試管渾濁。因此，抑制金黃色葡萄球菌肉眼可見生長(zhǎng)的最低藥物濃度為5號(hào)試管對(duì)應(yīng)的乳酸鏈球菌素濃度，即0.5 μg/mL。所以，乳酸鏈球菌素對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC值為0.5 μg/mL。

2.3 藥物對(duì)金黃色葡萄球菌的最小殺菌濃度

金黃色葡萄球菌在35 ℃培養(yǎng)24 h后對(duì)平板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，得出菌落數(shù)N=40，然后代入I值的計(jì)算公式，求得代表0.1%最初接種菌量的菌落數(shù)I值為28。

表2 藥物對(duì)金黃色葡萄球菌的最小殺菌濃度(N=3)

由表2可知，菌落計(jì)數(shù)≤28的平板所對(duì)應(yīng)的內(nèi)酯型槐糖脂試管編號(hào)為1#，2#，3#，所對(duì)應(yīng)的乳酸鏈球菌素試管編號(hào)為1#，2#，3#，4#。根據(jù)最小殺菌濃度的定義得出，內(nèi)酯型槐糖脂對(duì)金黃色葡萄球菌的最小殺菌濃度為64 μg/mL；乳酸鏈球菌素對(duì)金黃色葡萄球菌的最小殺菌濃度為1 μg/mL。

2.4 藥物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌動(dòng)力學(xué)

利用液體體外抑菌實(shí)驗(yàn)，測(cè)定內(nèi)酯型槐糖脂、乳酸鏈球菌素的活性與作用時(shí)間的關(guān)系，即抑菌藥物的抑菌動(dòng)力學(xué)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：內(nèi)酯型槐糖脂和乳酸鏈球菌素的藥物活性隨作用時(shí)間延長(zhǎng)均呈先上升后下降再趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)。兩者均在0～1 h出現(xiàn)一個(gè)活性峰，1 h之后活性下降，隨后一直趨于穩(wěn)定，見圖4。

圖4 藥物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性與作用時(shí)間的關(guān)系

2.5 藥物的相互作用研究

根據(jù)抑菌圈直徑以及MIC值的測(cè)定結(jié)果，采用微量棋盤稀釋法對(duì)內(nèi)酯型槐糖脂和乳酸鏈球菌素進(jìn)行聯(lián)合抑菌活性研究，并以FIC值進(jìn)行效果評(píng)價(jià)。內(nèi)酯型槐糖脂和乳酸鏈球菌素聯(lián)合抑菌效果見圖5。內(nèi)酯型槐糖脂聯(lián)用時(shí)的MIC為16 μg/mL，內(nèi)酯型槐糖脂單用時(shí)的MIC為32 μg/mL，乳酸鏈球菌素聯(lián)用時(shí)的MIC為0.5 μg/mL， 乳酸鏈球菌素單用時(shí)的MIC為0.5 μg/mL，然后代入FIC值的計(jì)算公式，求得FIC值為1.5，1<1.5<2，內(nèi)酯型槐糖脂和乳酸鏈球菌素聯(lián)合使用表現(xiàn)出無關(guān)作用。

圖5 內(nèi)酯型槐糖脂與乳酸鏈球菌素的藥物相互作用

注：A，B為2次平行實(shí)驗(yàn)。

3 討論與結(jié)論

槐糖脂是一種微生物源的表面活性劑，具有降低表面張力、乳化、分散、增溶等作用，可以應(yīng)用在食品加工過程中改善食品性狀、口味和品質(zhì)，槐糖脂不但能抑制細(xì)菌，也能抑制真菌，可以同時(shí)對(duì)食品起到防腐保鮮功能。因此有望開發(fā)成一種食品添加劑，既可以改善食品性狀和口味從而提高品質(zhì)，又可以防腐保鮮。一種添加劑能夠達(dá)到兩種目的，從而減少食品添加劑的使用種類。

槐糖脂既可以單獨(dú)使用，也可以與其他藥物聯(lián)合使用。已有文獻(xiàn)報(bào)道槐糖脂與臨床藥物聯(lián)合使用的效果。Sanada等報(bào)道槐糖脂作為皮膚吸收促進(jìn)劑能夠促進(jìn)聚六亞甲基雙胍的皮膚滲透而增強(qiáng)抗真菌作用[18]。Joshi-Navare等報(bào)道槐糖脂與四環(huán)素、槐糖脂和頭孢克洛聯(lián)合使用時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制呈現(xiàn)協(xié)同增效作用。但是，槐糖脂與乳酸鏈球菌素的聯(lián)合應(yīng)用未見報(bào)道。

乳酸鏈球菌素是乳酸鏈球菌產(chǎn)生的由多種氨基酸組成的多肽類化合物，是一種無毒的天然防腐劑，廣泛應(yīng)用于乳制品、罐頭制品、魚類制品、飲料等食品中。乳酸鏈球菌素能有效抑制引起食品腐敗的多種革蘭氏陽性細(xì)菌，如金黃色葡萄球菌、肉毒梭菌、李斯特氏菌等，其抗菌作用是通過干擾細(xì)胞膜的正常功能，造成細(xì)胞膜的滲透、養(yǎng)分流失和膜電位下降，從而導(dǎo)致致病菌和腐敗菌的死亡。

本文研究了內(nèi)酯型槐糖脂和乳酸鏈球菌素單獨(dú)使用以及兩者聯(lián)合使用，不同情況下對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制活性，探討槐糖脂單獨(dú)使用和兩者聯(lián)合應(yīng)用到食品中的可能性。

研究表明：內(nèi)酯型槐糖脂和乳酸鏈球菌素單獨(dú)使用時(shí)都能夠在短時(shí)間內(nèi)有效抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)繁殖，且表現(xiàn)出較小的MIC值，分別為32，0.5 μg/mL。雖然乳酸鏈球菌素的抑菌活性稍強(qiáng)，但槐糖脂單獨(dú)應(yīng)用到食品中能夠達(dá)到防腐保鮮和改良食品兩種目的。本研究首次證明槐糖脂與乳酸鏈球菌素聯(lián)合使用對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制表現(xiàn)出無關(guān)作用，沒有表現(xiàn)出拮抗作用。該結(jié)果與Joshi-Navare等報(bào)道的槐糖脂與四環(huán)素、槐糖脂與頭孢克洛的協(xié)同增效作用不一致，可能原因是四環(huán)素和頭孢克洛都是廣譜抗生素，抗菌能力強(qiáng)，而乳酸鏈球菌素只抑制革蘭氏陽性細(xì)菌?；碧侵腿樗徭溓蚓芈?lián)合使用不表現(xiàn)出拮抗作用，說明二者聯(lián)合應(yīng)用具有可能性。

本研究證明了槐糖脂單獨(dú)使用與槐糖脂和乳酸鏈球菌素聯(lián)合使用對(duì)金黃色葡萄球菌具有很強(qiáng)的抑制作用，且槐糖脂和乳酸鏈球菌素聯(lián)合使用不表現(xiàn)出拮抗作用，有望開發(fā)成槐糖脂食品添加劑和復(fù)合食品添加劑。

參考文獻(xiàn)：

[1]Mulligan C N.Environmental applications for biosurfactants[J].Environ Pollut,2005,133:183-198.

[2]Sun X X,Choi J K,Kim E K.A preliminary study on the mechanism of harmful algal bloom mitigation by use of sophorolipid treatment[J].J Exp Mar Biol Ecol,2004,304:35-49.

[3]Singh P,Cameotra S S.Potential applications of microbial surfactants in biomedical sciences [J].Trends in Biotechnol,2004,22:142-146.

[4]Cameotra S S,Makkar R S.Recent applications of biosurfactants as biological and immunological molecules[J].Curr Opin Microbiol,2004(7):262-266.

[5]Mulligan C N,Yong R N,Gibbs B F.Remediation technologies for metal contaminated soils and groundwater:an evaluation [J].Eng Geol,2001,60:193-207.

[6]Mulligan C N,Yong R N,Gibbs B F.Removal of heavy metals from contaminated soil and sediments using the biosurfactant surfactin [J].J Soil Contam,1999(8):231-254.

[7]Sun X X,Lee Y J,Choi J K,et al.Synergistic effect of sophorolipid and loess combination in harmful algal blooms mitigation[J].Mar Pollut Bull,2004,48:863-872.

[8]袁兵兵,楊?yuàn)檴?陳靜.微生物源槐糖脂對(duì)水果致腐真菌的抑制作用[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2011,17(3):330-333.

[9]Bogaert V,Saerens K,Muynck D C,et al.Microbial production and application of sophorolipids [J].Appl Microbiol Biotechnol,2007,76:23-34.

[10]Chen J,Song X,Qu Y B,et al.Studies on optimization of sophorolipid fermentation by yeast strain Y2A and antimicrobial activity of sophorolipid [J].Shandong Univ Nat Sci,2005,40(3):116-120.

[11]Yoo D S,Lee B S,Kim E K.Characteristics of microbial biosurfactant as an antifungal agent against plant pathogenic fungus[J].Microbiol Biotechnol,2005,15(6):1164-1169.

[12]Kim K J,Yoo D,Kim Y,et al.Characteristics of sophorolipid as an antimicrobial agent[J].Microbiol Biotechnol,2002,12(2):235-241.

[13]Shah V,Badia D,Ratsep P.Sophorolipids having enhanced antibacterial activity [J].Antimicrobial Agents and Chemotherapy,2007,51(1):397-400.

[14]Dengle-Pulate V,Chandorkar P,Bhagwat S,et al.Antimicrobial and SEM studies of sophorolipids synthesized using lauryl alcohol[J].Journal of Surfactants and Detergents,2014,17(3):543-552.

[15]董永勝,袁兵兵,陳靜.槐糖脂對(duì)水果致腐菌的抗菌作用及新型防腐保鮮劑的開發(fā)[D].濟(jì)南： 山東輕工業(yè)學(xué)院,2011.

[16]伏圣秘,陳靜.槐糖脂對(duì)作物病原真菌的抗菌作用及其新型生物殺菌劑的開發(fā)[D].濟(jì)南：齊魯工業(yè)大學(xué),2014.

[17]Joshi-Navare K,Prabhune A.A biosurfactant-sophorolipid acts in synergy with antibiotics to enhance their efficiency[J].BioMed Research International,2013,2013:1-8.

[18]Sanada H,Nakagami G,Takehara K,et al.Antifungal effect of non-woven textiles containing polyhexamethylene biguanide with sophorolipid:a potential method for tinea pedis prevention [J].Health Care,2014(2):183-191.