施瑞潔,韓夢(mèng)箐 ,馬 娟,張利俠,朱 娜 ,杜 潔

1.陜西省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科(西安710068),2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)檢驗(yàn)系(咸陽(yáng)712046)，3.陜西省人民醫(yī)院科研處(西安710068)，4.陜西省人民醫(yī)院健康體檢中心(西安710068)

結(jié)核病是一種主要通過空氣傳播的傳染性細(xì)菌感染性疾病，據(jù)報(bào)道，2014年世界范圍內(nèi)有 960萬例結(jié)核感染患者，其中150萬例死于結(jié)核病[1]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的統(tǒng)計(jì)，我國(guó)結(jié)核病患病人數(shù)居世界第二位，僅次于印度；我國(guó)不僅是全世界27個(gè)嚴(yán)重流行耐多藥結(jié)核病的國(guó)家之一，同時(shí)也是全世界22個(gè)結(jié)核病流行嚴(yán)重的國(guó)家之一[2]。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)因結(jié)核病而導(dǎo)致死亡的人數(shù)達(dá)到13萬人/年[3]，國(guó)家衛(wèi)計(jì)委已將結(jié)核病例為全國(guó)重點(diǎn)控制重大疾病之一[4]。

有研究顯示各國(guó)結(jié)核病的診斷均存在不同程度的診斷延誤[5-6]，而診斷延誤可導(dǎo)致患者感染期的延長(zhǎng)以及病情的惡化, 不但增加了患者和社會(huì)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān), 還可能導(dǎo)致結(jié)核疫情加劇，出現(xiàn)更多的感染者及更高的病死率。早期篩檢出結(jié)核病患者，縮短從出現(xiàn)癥狀到確診為結(jié)核的時(shí)間，并給以合理治療, 是控制和消滅傳染源、減少感染、降低發(fā)病的重要環(huán)節(jié)[7-8]，因此快速精準(zhǔn)的早期篩查和檢測(cè)結(jié)核菌感染尤為重要。

由于傳統(tǒng)的檢測(cè)結(jié)核病的方法存在缺陷，不能早期、有效的篩查出結(jié)核病，我們引入了新的檢測(cè)方法-結(jié)核T細(xì)胞酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SOPT.TB)。T-SOPT.TB是在酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)(ELISPOT)的基礎(chǔ)上應(yīng)用細(xì)胞免疫反應(yīng)建立起來的檢測(cè)單細(xì)胞水平分泌抗體或細(xì)胞因子的新型體外免疫檢測(cè)法[4]。本研究應(yīng)用T-SOPT.TB檢測(cè)2016年5-12月某院160例結(jié)核病患者與46例非結(jié)核病患者外周抗凝血單個(gè)核細(xì)胞結(jié)核特異性T淋巴細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞沉降率及涂片抗酸染色并分析。

材料與方法

1 研究對(duì)象 選取2016年5-12月某院確診為結(jié)核病患者160例為病例組，其中男97例，女63例，平均年齡57.1819.52歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：臨床表現(xiàn)結(jié)核癥狀，影像學(xué)、病理或抗酸染色確診為結(jié)核，排除妊娠，均未服用免疫抑制藥物。另選對(duì)照組46例，男25例，女21例，平均(61.3617.63)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：既往均無結(jié)核病史及結(jié)核病接觸史，胸部經(jīng)X線檢查無異常。病例組與對(duì)照組的年齡及性別比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 標(biāo)本采集

2.1 T-SOPT.TB試驗(yàn)：肝素鋰抗凝管常規(guī)采集靜脈血5ml。標(biāo)本采集后4h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室。

2.2 涂片抗酸染色：痰標(biāo)本采用合格的新鮮晨或液體標(biāo)本經(jīng)離心后取沉淀涂片，利用抗酸染色鏡檢。

2.3 紅細(xì)胞沉降率檢測(cè) ：專用血沉真空管常規(guī)抽取空腹靜脈血1.6ml。

3 試劑及儀器 淋巴細(xì)胞分離液和AIM-V培養(yǎng)液由美德太平洋(天津)生物科技股份有限公司提供；RPMI-1640培養(yǎng)基由天津生物科技有限公司提供；檢測(cè)結(jié)核T淋巴細(xì)胞酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)試劑盒由英國(guó)牛津提供：PBS洗板液由上海雙螺旋生物科技有限公司提供；酶結(jié)合物原液；無菌試管；無菌加樣頭；定量加樣器；生物安全柜；37℃培養(yǎng)溫箱；無菌痰杯；抗酸染色劑；ESR-030血沉儀；含有0.4ml，濃度為0.109mol/L檸檬酸鈉的專用血沉真空管。

4 方 法

4.1 T-STOP.TB試驗(yàn)方法：按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將外周抗凝血分離單個(gè)核細(xì)胞，將其洗滌，計(jì)數(shù)并稀釋至2.5×106個(gè)/ml的工作濃度細(xì)胞液，在微孔板中分別加入陰性對(duì)照細(xì)胞培養(yǎng)液，抗原A(ESAT-6，結(jié)核桿菌早期分泌蛋白)，抗原B(CFP10，培養(yǎng)濾液蛋白10)，陽(yáng)性對(duì)照(植物血凝素PHA)各50μl，每孔分別加入100ul稀釋好的細(xì)胞液(懸空加入，不沾染板孔)，放入CO2培養(yǎng)箱(37℃，5%CO2)培養(yǎng)16～20h。次日準(zhǔn)備10×PBS液(PBS蒸餾水稀釋得到)，以1∶200的比例將酶標(biāo)二抗原液與10×PBS洗滌液混合制成二抗工作液，將過夜培養(yǎng)的板孔中的培養(yǎng)液甩掉，每孔加入200μl 10×PBS液洗板，重復(fù)4遍后拍干板孔，每孔加入50μl二抗工作液4～80C孵育1h，洗滌微孔板加入顯色液避光靜置5～10min，用蒸餾水洗滌終止反應(yīng)。將孔板內(nèi)的液體拍干，讀取并記錄結(jié)果。

4.2 紅細(xì)胞沉降率檢測(cè)方法：病人空腹時(shí)，使用專用血沉真空管采集靜脈血，混勻后將血沉管豎直置于ESR-030自動(dòng)血沉分析儀,30min后查看結(jié)果。

4.3 痰涂片抗酸染色方法：病人清晨漱口后深咳送檢，取痰液涂片后紫外消毒30min后置于加熱臺(tái)熱固定1～2min；將石碳酸復(fù)紅蓋滿玻片，常溫染色10min后用流水沿玻片一端沖洗10～20s；滴加酸性酒精蓋滿玻片，脫色1～2min后流水沖洗；滴加亞甲藍(lán)溶液，覆滿玻片染色30s后用流水沖洗，濾紙擦干后可觀察。

4.4 T-STOP.TB試驗(yàn)判斷標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)為0～5個(gè)時(shí)(抗原A或抗原B孔的斑點(diǎn)數(shù))-(陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù))≥6，或者陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)為6-10個(gè)時(shí)(抗原A或抗原B孔的斑點(diǎn)數(shù))≥2×(陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù))為陽(yáng)性結(jié)果，不符合上述陽(yáng)性結(jié)果且陽(yáng)性對(duì)照孔正常則為陰性結(jié)果。

涂片抗酸染色 ：在顯微鏡下觀察每100個(gè)視野有≥3條抗酸桿菌即為陽(yáng)性結(jié)果。

紅細(xì)胞沉降率 ：男性15～49歲>15mm/h，50～85歲>20mm/h，86～110歲>30mm/h為紅細(xì)胞沉降率加快；女性15～49歲>20mm/h，50～85歲>30mm/h，86～110歲>45mm/h為紅細(xì)胞沉降率加快。

4.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，收集資料為計(jì)數(shù)資料，多個(gè)樣本率的比較采用χ2檢驗(yàn)，對(duì)于2個(gè)單元格的期望計(jì)數(shù)小于5，使用Fisher的精確檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)于計(jì)量資料的正態(tài)性檢驗(yàn)采用單樣本Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)分析，對(duì)兩獨(dú)立樣本的數(shù)據(jù)差異分析使用t檢驗(yàn)或Mann-Whitney U檢驗(yàn)。

結(jié) 果

1 160例結(jié)核病患者T-STOP.TB試驗(yàn)陽(yáng)性146例、敏感度91.3%；紅細(xì)胞沉降率檢測(cè)陽(yáng)性101例、敏感度63.1%；涂片抗酸染色陽(yáng)性67例、敏感度41.9%。T-STOP.TB敏感度高于紅細(xì)胞沉降率檢測(cè)與涂片抗酸染色，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=35.94，χ2=87.63，P<0.05)，見表1。

表1 160例結(jié)核病患者T-STOP.TB、紅細(xì)胞沉降率、抗酸染色敏感度

注:﹡T-STOP.TB VS 紅細(xì)胞沉降率；﹟T-STOP.TB VS 抗酸染色

2 46例非結(jié)核病患者T-STOP.TB試驗(yàn)44例陰性、特異度95.7%；紅細(xì)胞沉降率檢測(cè)22例陰性、特異度47.8%；涂片抗酸染色46例、特異度100.0%。T-STOP.TB試驗(yàn)特異度高于紅細(xì)胞沉降率，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=25.95，P<0.05)；T-STOP.TB試驗(yàn)特異度與抗酸染色相當(dāng)，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.495)，見表2。

3 T-STOP.TB試驗(yàn)、紅細(xì)胞沉降率檢測(cè)、涂片抗酸染色結(jié)果的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值分別為98.6%，80.8%，100%。T-STOP.TB試驗(yàn)的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值高于紅細(xì)胞沉降率，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=25.05，P<0.05)；T-STOP.TB試驗(yàn)的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值與抗酸染色相當(dāng)，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.0)，見表3。

4 T-STOP.TB試驗(yàn)、紅細(xì)胞沉降率檢測(cè)、涂片抗酸染色結(jié)果的陰性預(yù)測(cè)值分別為75.9%，27.2%，33.1%，T-STOP.TB試驗(yàn)的陰性預(yù)測(cè)值均高于紅細(xì)胞沉降率與抗酸染色，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=32.15，χ2=30.17，P<0.05)，見表4。

表2 46例結(jié)核病患者T-STOP.TB、紅細(xì)胞沉降率、抗酸染色特異度

注:﹡T-STOP.TB VS 紅細(xì)胞沉降率,﹟T-STOP.TB VS 抗酸染色﹟2個(gè)單元格的期望計(jì)數(shù)小于5，使用Fisher的精確檢驗(yàn)

表3 T-STOP.TB、紅細(xì)胞沉降率、抗酸染色陽(yáng)性預(yù)測(cè)值

注:﹡T-STOP.TB VS 紅細(xì)胞沉降率,﹟T-STOP.TB VS 抗酸染色,﹟2個(gè)單元格的期望計(jì)數(shù)小于5，使用Fisher的精確檢驗(yàn)

表4 T-STOP.TB、紅細(xì)胞沉降率、抗酸染色陰性預(yù)測(cè)值

注:*T-STOP.TB VS 紅細(xì)胞沉降率,﹟T-STOP.TB VS 抗酸染色

5 分析結(jié)核組與對(duì)照組T-SPOT.TB實(shí)驗(yàn)ESAT-6與CFP-10兩種抗原斑點(diǎn)數(shù)分布情況，采用單樣本Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)分析結(jié)核組兩種抗原斑點(diǎn)數(shù)的正態(tài)性分別為Z=0.216，P=0.000；Z=0.403，P=0.00認(rèn)為結(jié)核組兩種抗原斑點(diǎn)數(shù)均為非正態(tài)分布。結(jié)核組ESAT-6抗原的斑點(diǎn)數(shù)中位數(shù)±四分位數(shù)間距為43.00±69.75, 對(duì)照組ESAT-6抗原的斑點(diǎn)數(shù)中位數(shù)±四分位數(shù)間距3.50±9.00；結(jié)核組 CFP-10抗原的斑點(diǎn)數(shù)中位數(shù)±四分位數(shù)間距為56.00±87.50；對(duì)照組CFP-10抗原的斑點(diǎn)數(shù)中位數(shù)±四分位數(shù)間距3.00±9.00。采用兩獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)Mann-Whitney U分析兩種抗原診斷結(jié)核的差異性，結(jié)果顯示結(jié)核組T-SPOT.TB實(shí)驗(yàn)兩種抗原陽(yáng)性斑點(diǎn)數(shù)目均高于對(duì)照組(圖1)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-14.258，Z=-13.620，P=0.00)。

注:結(jié)核組與對(duì)照組比較，* P<0.05

6 上述結(jié)果可見，結(jié)核組兩種抗原斑點(diǎn)數(shù)均為非正態(tài)分布，利用(P2.5,P97.5)計(jì)算其95%可信區(qū)間，結(jié)核組ESAT-6抗原的斑點(diǎn)數(shù)95%可信區(qū)間(4.03,400.00)；CFP-10抗原的斑點(diǎn)數(shù)95%可信區(qū)間(4.03,500)。根據(jù)受試者工作特征曲線(ROC 曲線)，ESAT-6抗原的斑點(diǎn)數(shù)cut-off值取17.5時(shí)，ROC曲線下面積為0.960(高于0.9)，診斷結(jié)核的靈敏度和特異度分別可達(dá)到 81.9%和 98.7%(圖2A)；CFP-10抗原的斑點(diǎn)數(shù)cut-off值取19.0時(shí)，ROC曲線下面積為0.960(高于0.9)，診斷結(jié)核的靈敏度和特異度分別可達(dá)到76.9%和 98.7%(圖2B)。

圖2 結(jié)核組T-SPOT.TB兩種抗原斑點(diǎn)數(shù)ROC曲線

討 論

近年來我國(guó)結(jié)核病疫情出現(xiàn)回升趨勢(shì)，結(jié)核病防治形勢(shì)嚴(yán)峻，任務(wù)緊迫，實(shí)驗(yàn)室的檢驗(yàn)早期發(fā)現(xiàn)和準(zhǔn)確診斷是降低結(jié)核病發(fā)病率、減少傳播機(jī)會(huì)、控制結(jié)核病疫情的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[9]。目前，臨床診斷結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室檢查方法比較多，但都并不理想，容易造成結(jié)核病的誤診及漏診。

結(jié)核病是由結(jié)核桿菌感染引起的慢性傳染病。結(jié)核菌可能侵入人體全身各種器官，潛伏期4～8周。其中73%以上發(fā)生在肺部[10]，其他部位如頸淋巴、腦膜、腹膜、腸、皮膚、骨骼等也可繼發(fā)感染。故涂片抗酸染色雖然操作簡(jiǎn)單、診斷快速、費(fèi)用低廉，但檢測(cè)結(jié)果受技術(shù)人員水平的影響，檢測(cè)率低，且無法對(duì)肺外結(jié)核作出診斷[11]，故敏感度低。

患者感染結(jié)核菌時(shí)結(jié)核病變呈活動(dòng)性時(shí),血中纖維蛋白原及球蛋白含量增加,紅細(xì)胞沉降率會(huì)明顯增快，但紅細(xì)胞沉降率受影響因素較多，生理性如月經(jīng)、妊娠、高齡以及增多的纖維蛋白原；病理性的有炎癥、組織損傷、壞死、惡性腫瘤、高球蛋白血癥、貧血、高膽固醇血癥等，都能使紅細(xì)胞沉降率變快。有文獻(xiàn)報(bào)道41%活動(dòng)性結(jié)核性胸膜炎血沉正常[12]，而其特異度較差。

人與人之間呼吸道傳播是本病傳染的主要方式，傳染源是排菌的肺結(jié)核患者。隨著環(huán)境污染和艾滋病的傳播，結(jié)核病發(fā)病率越發(fā)強(qiáng)烈。除少數(shù)發(fā)病急促外，臨床上多呈慢性過程，常有低熱、乏力等全身癥狀和咳嗽、咯血等呼吸系統(tǒng)表現(xiàn)[13]。結(jié)核菌感染的免疫反應(yīng)主要是細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，作為細(xì)胞介導(dǎo)反應(yīng)的一部分，T淋巴細(xì)胞被結(jié)核菌抗原致敏，這些抗原再次刺激時(shí)，活化的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，主要CD4、部分CD8細(xì)胞產(chǎn)生γ干擾素[14]。結(jié)核特異性T細(xì)胞檢測(cè)實(shí)驗(yàn)將結(jié)核特異性抗原(ESAT-6/CFP-10)與外周血單個(gè)核細(xì)胞孵育，通過“雙抗夾心法”檢測(cè)釋放的γ-干擾素，從而檢測(cè)結(jié)核致敏的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，判斷患者是否存在結(jié)核感染，且T-SPOT.TB的T細(xì)胞定量應(yīng)答反應(yīng)可反映結(jié)核抗原負(fù)荷和疾病的活動(dòng)性,隨著活動(dòng)性肺結(jié)核的有效治療, 定量應(yīng)答反應(yīng)下降[15]。

本研究結(jié)果顯示，T-SPOT.TB試驗(yàn)的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值及陰性預(yù)測(cè)值均優(yōu)于紅細(xì)胞沉降率；T-SPOT.TB試驗(yàn)檢測(cè)的敏感度及陰性預(yù)測(cè)值優(yōu)于抗酸染色，特異度與陽(yáng)性預(yù)測(cè)值與抗酸染色相當(dāng)。且目前的報(bào)道都肯定了T-SPOT.TB試驗(yàn)的特異度和靈敏度[16]。進(jìn)一步證實(shí)了T-SPOT.TB試驗(yàn)對(duì)結(jié)核病患者有較好的診斷價(jià)值。在差異性分析中， T-SPOT.TB試驗(yàn)無論是ESAT-6抗原還是CFP-10抗原都在結(jié)核組與對(duì)照組中有顯著差異，對(duì)于結(jié)核病的診斷有極其重要的意義。此外，在ROC曲線分析中我們發(fā)現(xiàn)，T-SPOT.TB試驗(yàn)中ESAT-6抗原與CFP-10抗原對(duì)于診斷結(jié)核都有很好的敏感度和特異度，但CFP-10抗原相比ESAT-6抗原的敏感度稍差，在臨床上要結(jié)合兩種抗原結(jié)果綜合診斷。值得注意的是，在經(jīng)過抗結(jié)核治療后的患者，其效應(yīng)T淋巴細(xì)胞數(shù)目減少[15]，可造成假陰性結(jié)果，部分正常人或者非結(jié)核病患者接觸結(jié)核病患者可能發(fā)生潛伏感染而導(dǎo)致假陽(yáng)性，故需要結(jié)合臨床來判斷。

綜上所述，常用的結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室的診斷方法難以滿足臨床早期準(zhǔn)確診斷結(jié)核病的需要,但T-SPOT.TB檢測(cè)方法以ESAT-6和CFP-10為結(jié)核特異性蛋白抗原，能夠快速、準(zhǔn)確的診斷結(jié)核病感染,對(duì)于控制傳染源,降低感染率具有重要社會(huì)意義和流行病學(xué)意義,對(duì)于減少結(jié)核病額誤診漏診率,提高結(jié)核感染診斷率和治愈率具有重要臨床意義。

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