朱杰，張琰，張超，唐盺瑩，張洪波，王祥，宋宇峰，周東明，王慶林

1. 湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，長沙 410013； 2. 中國科學(xué)院上海巴斯德研究所疫苗中心，上海 200031

隨著新型禽流感病毒H7N9感染病例的相繼報道，自2013年初至2017年6月，其已在中國經(jīng)歷了5個流行周期，造成 1 552 例人感染H7N9病例，病死率約40%[1]。2016年12月在廣東省首次發(fā)現(xiàn)高致病性H7N9病毒，其母源病毒來自2015年的長江三角洲流行地區(qū)，但母源病毒呈低致病性[2]。2017年初在湖南省和廣西壯族自治區(qū)等地區(qū)也發(fā)現(xiàn)高致病性H7N9病毒[3]。禽流感病毒H7N9由于致病性低，僅引起禽類的無癥狀感染，此前很少受到關(guān)注。但新型H7N9病毒能引起人類發(fā)生高熱、肺炎和其他呼吸道癥狀及多器官功能衰竭等嚴(yán)重疾病被報道后，人們對其的關(guān)注度日益提高[4-6]。

中國人日常生活中活禽市場普遍存在。但活禽市場對家禽來源的監(jiān)管力度不夠，特別是個體農(nóng)戶自由放養(yǎng)的家禽很容易被野禽攜帶的禽流感病毒感染。有報道稱，在大多數(shù)流行地區(qū)，人通過與活禽市場接觸而被感染，意味著活禽市場與人類之間存在流行病學(xué)聯(lián)系[7]?；钋菔袌鲋屑仪輥碓吹膹?fù)雜性有利于不同亞型禽流感病毒在不同品種家禽之間相互傳播[8-11]。新型H7N9病毒的HA基因與來自鴨的H7N3病毒有關(guān)，NA基因與來自野生候鳥的H2N9和H11N9病毒有關(guān)，其他基因可能來自H9N2病毒[12-14]。

蘇州位于中國江蘇省南部，是一個重要的經(jīng)濟(jì)交通中心。西面為中國五大淡水湖之一的太湖,且與浙江省和上海市毗鄰，而后兩地是2013年H7N9病毒流行的主要受影響地區(qū)。太湖的天然濕地是東亞-澳大利亞候鳥遷徙路線中的歇息地，有許多野生鳥類。這種新型H7N9病毒在太湖周圍其他城市的活禽市場中也被發(fā)現(xiàn)并報道，如湖州[15]和嘉興[16]，但其在蘇州的流行病學(xué)尚不清楚。本研究于2013年7—12月在H7N9病毒主要流行地區(qū)之一江蘇省蘇州市活禽市場采集2 655份雞、鴨咽拭子樣本，對樣本中的流感病毒進(jìn)行核酸檢測，并進(jìn)一步對H7N9陽性樣本中的HA、NA和PB2基因進(jìn)行測序，通過系統(tǒng)進(jìn)化分析來追蹤新型H7N9病毒的進(jìn)化史。

1 材料與方法

1.1 咽拭子收集

2013年7—12月，于蘇州活禽市場隨機(jī)收集雞、鴨咽拭子，共計 2 655 份樣本。樣本保存于 2～3 mL含100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的 Hank’s 液中，于-70 ℃凍存。

1.2 病毒擴(kuò)增

選擇發(fā)育良好的9～11日齡無特定病原體(specific pathogen free，SPF)雞胚，常規(guī)無菌處理咽拭子樣本。取適量樣本溶液，用無菌環(huán)接種于雞胚尿囊腔，放入37 ℃孵育箱培養(yǎng)。接種后24 h內(nèi)將死亡的雞胚舍棄；24 h后，每天照蛋2次，如發(fā)現(xiàn)雞胚死亡，立即放入冰箱暫存；孵育36～48 h后，收取尿囊液。將完成病毒擴(kuò)增的尿囊液凍存于-70 ℃。上述所有操作均在生物安全三級(biosafety level 3，BSL-3)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成。

1.3 RNA提取和反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)

按RNA提取操作步驟, 用TRIzol試劑(Invitrogen公司)提取尿囊液中的病毒RNA[17]。取適量尿囊液置于RNase-free EP管中，加入TRIzol試劑劇烈振蕩后，室溫靜置；加入氯仿(氯仿體積為TRIzol試劑的1/5)，劇烈振蕩后室溫靜置；將RNase-free EP管放入 4 ℃ 預(yù)冷的離心機(jī)中，12 000 r/min于4 ℃離心 20 min；用無菌槍頭(Thermo Scientific公司)取上層液體置于另一新的RNase-free EP管中，加入異丙醇，上下顛倒混勻，室溫靜置或-80 ℃靜置；將RNase-free EP管離心，棄上清液，每管加入適量75%乙醇洗滌RNA沉淀，然后離心；棄上清液，室溫靜置晾干；將純化后的RNA溶解于10 μL DEPC水(中國大連TaKaRa公司)。使用通用引物Uni12將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)參數(shù)：去DNA體系 42 ℃ 3 min，16 ℃暫存；反轉(zhuǎn)錄體系 42 ℃ 15 min，95 ℃ 3 min，16 ℃暫存。將得到的cDNA存于 -80 ℃。以cDNA為模板，使用3對特殊引物擴(kuò)增H5、H7和H9亞型基因片段，以檢測這些樣本中禽流感病毒的混合感染。本研究所使用引物詳見表1。

表1PCR和測序引物

Tab.1PCRandsequencingprimersusedinthisstudy

Primers Sequences (5'-3')H5-155f5'-ACACATGCYCARGACATACT-3'H5-699r5'-CTYTGRTTYAGTGTTGATGT-3'H9-151f5'-CTYCACACAGARCACAATGG-3'H9-638r5'-GTCACACTTGTTGTTGTRTC-3'NA9-975f5'-TGTAATGACCCTTATCCAGG-3'NA9-1382r5'-GTTCCATTGTCCAAGGAATTC-3'H7-12f5'-GGGATACAAAATGAAYACTC-3'H7-645r5'-CCATABARYYTRGTCTGYTC-3'Bm-PB2-15'-TATTGGTCTCAGGGAGCGAAAGCAG- GTC-3'PB2-1250R5'-TCYTCYTGTGARAAYACCAT-3'RV-M5'-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3'M13-475'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'Uni125'-AGCAAAAGCAGG-3'

1.4 測序和禽流感病毒的系統(tǒng)進(jìn)化分析

將擴(kuò)增的HA、NA和PB2基因片段克隆至pMD18-T載體(中國大連TaKaRa公司)，采用RV-M和M13-47引物，ABI 3730XL遺傳分析儀(ABI公司)的Sanger雙脫氧測序法進(jìn)行測序。將獲得的HA、NA和PB2核酸序列提交至全球共享禽流感倡議組織(Global Initiative on Sharing All Influenza Data，GISAID)-EpiFlu數(shù)據(jù)庫，基因序列號為EPI_ISL_205835～EPI_ISL_205849。對收集到的樣本序列進(jìn)行多線程擴(kuò)增，用ClustalW軟件將GenBank和GISAID數(shù)據(jù)庫作為數(shù)據(jù)源分析收集到的序列數(shù)據(jù)。采用鄰接法(neighbor-joining method)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，在Kimura 2核酸替代模型中重復(fù)抽樣1 000次對進(jìn)化樹進(jìn)行驗(yàn)證。成對的核苷酸同源性計算中包括所有3個密碼子的位置和成對丟失的情況，所有計算采用Mega 6.06軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 樣本陽性率檢測

本研究共采集 2 655 份咽拭子樣本(雞 2 155 份，鴨 500份)，采用RT-PCR檢測H5、H7和H9亞型的病毒基因。結(jié)果顯示，H5、H7和H9亞型的陽性率分別為 0.87%(23/2 655)、1.62%(43/2 655)和 2.82%(75/2 655)(表 2)。7—9月樣本中各病毒陽性檢出率較低，而10—12月樣本中各病毒陽性檢出率呈逐漸上升趨勢。根據(jù)蘇州的天氣記錄，2013年7—12月的月平均氣溫分別為 36.32 ℃、35.10 ℃、28.23 ℃、23.03 ℃、17.60 ℃ 和 10.42 ℃(http://www.accuweather.com/)，月平均溫度的變化與H5(r=-0.906，P=0.013)、H7(r=-0.837，P=0.038)和H9(r=-0.869，P=0.024)亞型陽性檢出率呈負(fù)相關(guān)，且有統(tǒng)計學(xué)意義。上述結(jié)果提示，氣溫>25 ℃時，禽流感病毒在家禽中的暴發(fā)相對減少，大致推斷家禽對流感病毒的易感溫度范圍為12～15 ℃[18-19]。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)了禽流感病毒H5、H7和H9亞型之間的混合感染：H7和H9為 0.94%(25/2 655)，H5和H7為 0.08%(2/2 655)，H5和H9為 0.26%(7/2 655)，H5、H7和H9為 0.30%(8/2 655)。H7和H9亞型之間重組概率最高?；旌细腥究赡墚a(chǎn)生引起人類流感大流行的強(qiáng)毒株。

表2咽拭子中的禽流感病毒

Tab.2Theprevalenceofavianinfluenzavirusesinswabsamples

Monthn(%)H5H7H9Swab samplesJul. 20130(0)0(0)7(1.17)600Aug. 20130(0)5(0.89)11(1.96)560Sept. 20131(0.25)5(1.25)11(2.75)400Oct. 20132(0.34)10(1.72)8(1.38)580Nov. 20137(2.80)4(1.60)17(6.80)250Dec. 201313(4.91)19(7.17)21(7.92)265Total23(0.87)43(1.62)75(2.82)2 655

2.2 基因序列分析

針對得到的核酸序列，在基于HA和NA核酸序列基礎(chǔ)上進(jìn)行亞型和系統(tǒng)進(jìn)化分析。

如圖1所示，HA基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析主要基于H5、H7和H9亞型。結(jié)果顯示，從蘇州活禽市場中分離獲得的病毒與從感染新型H7N9病毒的臨床患者中分離獲得的病毒(A/Anhui/1/2013株和A/Huzhou/3/2013株等)高度同源，這些毒株之間HA基因序列同源性最高為 98.7%，提示H7N9病毒存在人類與禽類之間傳播的風(fēng)險。

The dendrogram was constructed by using the neighbor-joining method based on the alignment of the partial sequences of the HA region of Suzhou influenza strains and other reference strains downloaded from GenBank or GISAID. Bootstrap values (%) for 1 000 replicates were calculated, and only values >80% are shown at the nodes. Red dots indicate Suzhou isolates in this study, and green triangles indicate the clinical isolates from patients.

圖1流感病毒HA核苷酸序列進(jìn)化樹

Fig.1PhylogeneticdendrogrambasedonHAnucleotidesequencesoftheinfluenzaviruses

NA基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析主要基于N9和N2兩個亞型(圖2)。結(jié)果顯示，從蘇州活禽市場中分離獲得的病毒與從長江三角洲區(qū)域患者和禽類中分離獲得的新型H7N9病毒也高度同源，NA基因序列的相似率最高達(dá) 96.4%。禽類樣本與臨床患者樣本之間的密切聯(lián)系進(jìn)一步明確了可能存在從家禽到人類的傳播鏈。值得注意的是， 2013年從上海第1例感染H7N9病毒的患者中分離得到的病毒，在HA和NA進(jìn)化樹中同樣位于新型H7N9病毒分支中的基底分支，提示2013年1月從上?；颊唧w內(nèi)分離到的禽流感病毒與蘇州活禽市場樣本中的禽流感病毒有同源性。

The dendrogram was constructed by using the neighbor-joining method based on the alignment of the partial sequences of the NA region of Suzhou influenza strains and other reference strains downloaded from GenBank or GISAID. Bootstrap values (%) for 1 000 replicates were calculated, and only values >80% are shown at the nodes. Red dots indicate Suzhou isolates in this study, and green triangles indicate the clinical isolates from patients.

圖2流感病毒NA核苷酸序列進(jìn)化樹

Fig.2PhylogeneticdendrogrambasedonNAnucleotidesequencesoftheinfluenzaviruses

根據(jù)PB2基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹可分為4個分支(圖 3)。分支Ⅰ：主要為2013年分離到的H7N9病毒；分支Ⅱ：主要為2013年分離到的H9N2病毒；分支Ⅲ：主要包含2013年和2014年分離到的H9N2病毒和H7N9病毒；分支Ⅳ：主要為H5N1病毒。從蘇州活禽市場樣本中分離獲得的病毒中，分支Ⅲ有8種，分支Ⅱ有3種。結(jié)果表明，蘇州活禽市場樣本中的病毒可能源于與H9N2亞型的基因重排。分支Ⅳ中，A/Chicken/Suzhou/12-8/2013株與H5N1毒株相似，表明禽類中也出現(xiàn)了與H5N1的基因重排。此外，H9N2兩個參考株(EPI145385 和 EPI145390)作為分支Ⅲ的基礎(chǔ)分支，其基因序列比同分支中其他H9N2株更接近A/Chicken/Suzhou/11-26/2013株。結(jié)果表明，H7N9和H9N2的PB2基因可能為相同來源，提示H7N9的PB2基因可能源于早期的H9N2毒株。

The dendrogram was constructed by using the neighbor-joining method based on the alignment of the partial sequences of the PB2 region of Suzhou influenza strains and other reference strains downloaded from GenBank or GISAID. Bootstrap values (%) for 1 000 replicates were calculated, and only values >80% are shown at the nodes. Red dots indicate Suzhou isolates in this study, and green triangles indicate the clinical isolates from patients.

圖3流感病毒PB2核苷酸序列進(jìn)化樹

Fig.3PhylogeneticdendrogrambasedonPB2nucleotidesequencesoftheinfluenzaviruses

3 討論

有研究表明，H9N2禽流感病毒在新型H7N9病毒的基因重排中起重要作用[20-22]，而H5亞型與H9N2在進(jìn)化方面密切相關(guān)[23]。通過PCR檢測 2 655 份咽拭子樣本中的H5、H7和H9亞型，確認(rèn)蘇州活禽市場中3種HA亞型的流行情況，同時探討家禽在H7N9及相關(guān)病毒持續(xù)基因重排傳代中的作用。結(jié)果顯示，所有樣本中H7(1.62%)和H9(2.82%)的陽性率高于H5(0.87%)，表明H7與H9亞型之間更有機(jī)會發(fā)生重排。盡管HA的3種亞型存在混合感染，但H7N9與H9N2混合感染出現(xiàn)的頻率最高。此外，所有混合感染僅存在于雞樣本中，意味著雞體內(nèi)更適合多種禽流感病毒的共存，新型病毒更容易在活禽市場產(chǎn)生[24]。樣本陽性率隨時間變化顯現(xiàn)：從7月到9月逐漸降低，10月到12月逐漸增高。季節(jié)性溫度變化影響家禽間禽流感病毒的傳播，低溫和相對高濕度有利于病毒傳播[25-26]，這可能是2013年至2014年冬季中國若干省份出現(xiàn)H7N9第二波暴發(fā)及迅速傳播的原因。

HA和NA基因片段的進(jìn)化樹分析顯示，從蘇州活禽市場中分離獲得的H7N9病毒與從周邊城市上海、湖州分離獲得的H7N9毒株非常接近，意味著長江三角洲區(qū)域傳播的新型H7N9病毒可能有共同起源。此外，PB2基因片段的系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，新出現(xiàn)的H7N9病毒PB2基因在H9N2和H5N1中也存在，提示PB2基因片段可能是這3種病毒基因重排的結(jié)果。本研究獲得的病毒中有3株接近臨床患者A/Shanghai/1/2013株，A/chicken/Suzhou/12-8/2013株接近H5N1亞型，其他接近H9N2亞型。A/chicken/Suzhou/12-8/2013株接近H5N1毒株提示其他類型的基因多重重排有可能正在進(jìn)行。新型H7N9病毒的PB2基因在哺乳動物感染流感病毒中起重要作用[27]。鑒于PB2基因的多重重排很可能產(chǎn)生能感染人類的新型禽流感病毒，蘇州活禽市場需持續(xù)監(jiān)控。

蘇州位于中國江蘇省南部，屬于長江三角洲區(qū)域，擁有高密度的活禽市場和人口。在太湖，禽流感病毒在不同物種之間的共感染是病毒亞型多樣化的重要條件，這也可能是與之毗鄰的蘇州更容易遭受禽流感病毒攻擊的原因之一[28]。2013年4月蘇州確診的H7N9病毒感染事件有2例，2014年有4例，且被感染者均有近期接觸家禽的經(jīng)歷。遺憾的是，本研究缺乏確診案例中H7N9病毒的序列，無法闡明活禽市場所獲病毒與2014年H7N9感染病例之間的關(guān)系。但值得注意的是，蘇州可能是H7N9病毒的傳播來源之一。2013年4月和2015年1月，蘇州市政府關(guān)閉活禽市場以控制H7N9病毒的流行，同時還禁止一些小規(guī)模農(nóng)貿(mào)市場中的個體農(nóng)戶出售活禽。這些措施是有效的，因?yàn)?015年僅零星出現(xiàn)了人感染病例。但長期關(guān)閉活禽市場不現(xiàn)實(shí)，考慮到之前提出的禽流感病毒的季節(jié)性變化，因此對活禽市場的監(jiān)測應(yīng)主要放在冬季。禽流感病毒在家禽中的高流行率、遺傳多樣性和廣泛的宿主范圍意味著其能持續(xù)通過重排形成新病毒，并可能引起再次流行。因此，受影響地區(qū)急需對家禽中所有禽流感病毒亞型進(jìn)行持續(xù)監(jiān)測，用整個8序列片段來檢測基因重排病毒也值得考慮。在中國，改善家禽飼養(yǎng)方式及監(jiān)控家禽供應(yīng)鏈中的每一個環(huán)節(jié)均對流感防控至關(guān)重要。

[1] Tang J, Wang D. Research progress in human infection with avian influenza H7N9 virus [J]. Sci China Life Sci, 2017, 60(12): 1299-1306.

[2] Kang M, Lau EHY, Guan W, Yang Y, Song T, Cowling BJ, Wu J, Peiris M, He J, Mok CKP. Epidemiology of human infections with highly pathogenic avian influenza A(H7N9) virus in Guangdong, 2016 to 2017 [J]. Euro Surveill, 2017, 22(27). doi: 10.2807/1560-7917.ES.2017.22.27.30568.

[3] Artois J, Jiang H, Wang X, Qin Y, Pearcy M, Lai S, Shi Y, Zhang J, Peng Z, Zheng J, He Y, Dhingra MS, von Dobschuetz S, Guo F, Martin V, Kalpravidh W, Claes F, Robinson T, Hay SI, Xiao X, Feng L, Gilbert M, Yu H. Changing geographic patterns and risk factors for avian influenza A (H7N9) infections in humans, China [J]. Emerg Infect Dis, 2018, 24(1): 87-94.

[4] Yu H, Cowling BJ, Feng L, Lau EH, Liao Q, Tsang TK, Peng Z, Wu P, Liu F, Fang VJ, Zhang H, Li M, Zeng L, Xu Z, Li Z, Luo H, Li Q, Feng Z, Cao B, Yang W, Wu JT, Wang Y, Leung GM. Human infection with avian influenza A H7N9 virus: an assessment of clinical severity [J]. Lancet, 2013, 382(9887): 138-145.

[5] Gao HN, Lu HZ, Cao B, Du B, Shang H, Gan JH, Lu SH, Yang YD, Fang Q, Shen YZ, Xi XM, Gu Q, Zhou XM, Qu HP, Yan Z, Li FM, Zhao W, Gao ZC, Wang GF, Ruan LX, Wang WH, Ye J, Cao HF, Li XW, Zhang WH, Fang XC, He J, Liang WF, Xie J, Zeng M, Wu XZ, Li J, Xia Q, Jin ZC, Chen Q, Tang C, Zhang ZY, Hou BM, Feng ZX, Sheng JF, Zhong NS, Li LJ. Clinical findings in 111 cases of influenza A (H7N9) virus infection [J]. N Engl J Med, 2013, 368(24): 2277-2285.

[6] Li Q, Zhou L, Zhou M, Chen Z, Li F, Wu H, Xiang N, Chen E, Tang F, Wang D, Meng L, Hong Z, Tu W, Cao Y, Li L, Ding F, Liu B, Wang M, Xie R, Gao R, Li X, Bai T, Zou S, He J, Hu J, Xu Y, Chai C, Wang S, Gao Y, Jin L, Zhang Y, Luo H, Yu H, He J, Li Q, Wang X, Gao L, Pang X, Liu G, Yan Y, Yuan H, Shu Y, Yang W, Wang Y, Wu F, Uyeki TM, Feng Z. Epidemiology of human infections with avian influenza A(H7N9) virus in China [J]. N Engl J Med, 2014, 370(6): 520-532.

[7] Yu H, Wu JT, Cowling BJ, Liao Q, Fang VJ, Zhou S, Wu P, Zhou H, Lau EH, Guo D, Ni MY, Peng Z, Feng L, Jiang H, Luo H, Li Q, Feng Z, Wang Y, Yang W, Leung GM. Effect of closure of live poultry markets on poultry-to-person transmission of avian influenza A H7N9 virus: an ecological study [J]. Lancet, 2014, 383(9916): 541-548.

[8] Nguyen DC, Uyeki TM, Jadhao S, Maines T, Shaw M, Matsuoka Y, Smith C, Rowe T, Lu X, Hall H, Xu X, Balish A, Klimov A, Tumpey TM, Swayne DE, Huynh LP, Nghiem HK, Nguyen HHT, Hoang LT, Cox NJ, Katz JM. Isolation and characterization of avian influenza viruses, including highly pathogenic H5N1, from poultry in live bird markets in Hanoi, Vietnam, in 2001 [J]. J Virol, 2005, 79(7): 4201-4212.

[9] Wan XF, Dong L, Lan Y, Long LP, Xu C, Zou S, Li Z, Wen L, Cai Z, Wang W, Li X, Yuan F, Sui H, Zhang Y, Dong J, Sun S, Gao Y, Wang M, Bai T, Yang L, Li D, Yang W, Yu H, Wang S, Feng Z, Wang Y, Guo Y, Webby RJ, Shu Y. Indications that live poultry markets are a major source of human H5N1 influenza virus infection in China [J]. J Virol, 2011, 85(24): 13432-13438.

[10] Paul M, Baritaux V, Wongnarkpet S, Poolkhet C, Thanapongtharm W, Roger F, Bonnet P, Ducrot C. Practices associated with highly pathogenic avian influenza spread in traditional poultry marketing chains: Social and economic perspectives [J]. Acta Trop, 2013, 126(1): 43-53.

[11] Liu D, Shi W, Shi Y, Wang D, Xiao H, Li W, Bi Y, Wu Y, Li X, Yan J, Liu W, Zhao G, Yang W, Wang Y, Ma J, Shu Y, Lei F, Gao GF. Origin and diversity of novel avian influenza A H7N9 viruses causing human infection: phylogenetic, structural, and coalescent analyses [J]. Lancet, 2013, 381(9881): 1926-1932.

[12] Gao R, Cao B, Hu Y, Feng Z, Wang D, Hu W, Chen J, Jie Z, Qiu H, Xu K, Xu X, Lu H, Zhu W, Gao Z, Xiang N, Shen Y, He Z, Gu Y, Zhang Z, Yang Y, Zhao X, Zhou L, Li X, Zou S, Zhang Y, Li X, Yang L, Guo J, Dong J, Li Q, Dong L, Zhu Y, Bai T, Wang S, Hao P, Yang W, Zhang Y, Han J, Yu H, Li D, Gao GF, Wu G, Wang Y, Yuan Z, Shu Y. Human infection with a novel avian-origin influenza A (H7N9) virus [J]. N Engl J Med, 2013, 368(20): 1888-1897.

[13] Lam TT, Wang J, Shen Y, Zhou B, Duan L, Cheung CL, Ma C, Lycett SJ, Leung CY, Chen X, Li L, Hong W, Chai Y, Zhou L, Liang H, Ou Z, Liu Y, Farooqui A, Kelvin DJ, Poon LL, Smith DK, Pybus OG, Leung GM, Shu Y, Webster RG, Webby RJ, Peiris JS, Rambaut A, Zhu H, Guan Y. The genesis and source of the H7N9 influenza viruses causing human infections in China [J]. Nature, 2013, 502(7470): 241-244.

[14] Wu A, Su C, Wang D, Peng Y, Liu M, Hua S, Li T, Gao GF, Tang H, Chen J, Liu X, Shu Y, Peng D, Jiang T. Sequential reassortments underlie diverse influenza H7N9 genotypes in China [J]. Cell Host Microbe, 2013, 14(4): 446-452.

[15] Han J, Wang L, Liu J, Jin M, Hao F, Zhang P, Zhang Z, Wen D, Wu X, Liu G, Ji L, Xu D, Zhou D, Leng Q, Lan K, Zhang C. Cocirculation of three hemagglutinin and two neuraminidase subtypes of avian influenza viruses in Huzhou, China, April 2013: implication for the origin of the novel H7N9 virus [J]. J Virol, 2014, 88(11): 6506-6511.

[16] Sun Y, Wang H, Lou X, Mao H, Yan Y, Chen E, Wang X, Li Z, Gao J, Fu X, Chen Z, Feng Y, Chen Z, Zhang Y. Living poultry markets in rural area: Human infection with H7N9 virus re-emerges in Zhejiang Province, China, in winter 2014 [J]. J Clin Virol, 2015, 70: 16-22.

[17] Zhou D, Wu TL, Lasaro MO, Latimer BP, Parzych EM, Bian A, Li Y, Li H, Erikson J, Xiang Z, Ertl HC. A universal influenza A vaccine based on adenovirus expressing matrix-2 ectodomain and nucleoprotein protects mice from lethal challenge [J]. Mol Ther, 2010, 18(12): 2182-2189.

[18] Fang LQ, Li XL, Liu K, Li YJ, Yao HW, Liang S, Yang Y, Feng ZJ, Gray GC, Cao WC. Mapping spread and risk of avian influenza A (H7N9) in China [J]. Sci Rep, 2013, 3: 2722. doi: 10.1038/srep02722.

[19] Zhang Z, Chen D, Chen Y, Wang B, Hu Y, Gao J, Sun L, Li R, Xiong C. Evaluating the impact of environmental temperature on global highly pathogenic avian influenza (HPAI) H5N1 outbreaks in domestic poultry [J]. Int J Environ Res Public Health, 2014, 11(6): 6388-6399.

[20] Zhang L, Zhang Z, Weng Z. Rapid reassortment of internal genes in avian influenza A(H7N9) virus [J]. Clin Infect Dis, 2013, 57(7): 1059-1061.

[21] Yu X, Jin T, Cui Y, Pu X, Li J, Xu J, Liu G, Jia H, Liu D, Song S, Yu Y, Xie L, Huang R, Ding H, Kou Y, Zhou Y, Wang Y, Xu X, Yin Y, Wang J, Guo C, Yang X, Hu L, Wu X, Wang H, Liu J, Zhao G, Zhou J, Pan J, Gao GF, Yang R, Wang J. Influenza H7N9 and H9N2 viruses: coexistence in poultry linked to human H7N9 infection and genome characteristics [J]. J Virol, 2014, 88(6): 3423-3431.

[22] Liu W, Fan H, Raghwani J, Lam TT, Li J, Pybus OG, Yao HW, Wo Y, Liu K, An XP, Pei GQ, Li H, Wang HY, Zhao JJ, Jiang T, Ma MJ, Xia X, Dong YD, Zhao TY, Jiang JF, Yang YH, Guan Y, Tong Y, Cao WC. Occurrence and reassortment of avian influenza A (H7N9) viruses derived from coinfected birds in China [J]. J Virol, 2014, 88(22): 13344-13351.

[23] Iqbal M, Yaqub T, Reddy K, McCauley JW. Novel genotypes of H9N2 influenza A viruses isolated from poultry in Pakistan containing NS genes similar to highly pathogenic H7N3 and H5N1 viruses [J]. PLoS One, 2009, 4(6): e5788.

[24] Chen Y, Liang W, Yang S, Wu N, Gao H, Sheng J, Yao H, Wo J, Fang Q, Cui D, Li Y, Yao X, Zhang Y, Wu H, Zheng S, Diao H, Xia S, Zhang Y, Chan KH, Tsoi HW, Teng JL, Song W, Wang P, Lau SY, Zheng M, Chan JF, To KK, Chen H, Li L, Yuen KY. Human infections with the emerging avian influenza A H7N9 virus from wet market poultry: clinical analysis and characterisation of viral genome [J]. Lancet, 2013, 381(9881): 1916-1925.

[25] Lowen AC, Mubareka S, Steel J, Palese P. Influenza virus transmission is dependent on relative humidity and temperature [J]. PLoS Pathog, 2007, 3(10): 1470-1476.

[26] Soebiyanto RP, Adimi F, Kiang RK. Modeling and predicting seasonal influenza transmission in warm regions using climatological parameters [J]. PLoS One, 2010, 5(3): e9450.

[27] Yamayoshi S, Fukuyama S, Yamada S, Zhao D, Murakami S, Uraki R, Watanabe T, Tomita Y, Neumann G, Kawaoka Y. Amino acids substitutions in the PB2 protein of H7N9 influenza A viruses are important for virulence in mammalian hosts [J]. Sci Rep, 2015, 5: 8039. doi: 10.1038/srep08039.

[28] Sharp GB, Kawaoka Y, Jones DJ, Bean WJ, Pryor SP, Hinshaw V, Webster RG. Coinfection of wild ducks by influenza A viruses: distribution patterns and biological significance [J]. J Virol, 1997, 71(8): 6128-6135.