李華瑋,姬鵬超,王永芬,趙緒永,何 健,趙孟孟

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學院生物工程學院,河南 鄭州 450046;2.河南農(nóng)業(yè)大學牧醫(yī)工程學院,河南 鄭州 450002)

豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是一種造成母豬流產(chǎn)、死胎、仔豬呼吸道感染等死亡率較高的疾病,該病的病原是豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(PRRSV)。該病1987年首次在美國報道,隨后世界蔓延,我國在1996年報道該病[1],2006年暴發(fā),致大量豬群死亡,2015年又出現(xiàn)新的亞型[2]。對于該種傳染病一直未有有效的藥物和疫苗。

該病毒的非結構蛋白Nsp9蛋白是主要編碼RNA依賴的RNA聚合酶的功能蛋白,該蛋白僅在病毒復制時出現(xiàn),對診斷滅活苗與弱毒苗具有重要意義[3-5]。之前有文獻報道Nsp9基因與病毒毒力相關,并且該基因上存在T細胞和B細胞表位[6-8],與病毒抗利巴韋林耐藥性相關[9],Nsp9基因與宿主多種蛋白互相作用促進病毒復制[10-13],并且將弱毒株Ch-1R的Nsp9基因替換到強毒株XH-GD的感染性克隆上,可提高其親本毒株的滴度[14]。

研究結果表明,強弱毒株的Nsp9基因之間存在12個氨基酸突變[15],究竟是哪一個氨基酸與病毒復制相關尚未可知。本研究在之前構建的PRRSV的XH-GD感染性克隆基礎上,通過融合PCR方法設計突變質(zhì)粒,使Nsp9蛋白第642位氨基酸由組氨酸突變?yōu)槔野彼?其中感染性克隆骨架為強毒株XH-GD,該毒株第642位氨基酸為組氨酸。2006年之前的弱毒株的Nsp9基因第642位氨基酸為酪氨酸。本研究的目的是探索Nsp9基因第642位氨基酸突變之后對病毒復制的影響。結果表明,突變之后病毒滴度未有顯著變化,第642位氨基酸不是決定病毒滴度的關鍵氨基酸,與Nsp9基因轉錄有關。

1　材料與方法

1.1細胞、菌株和載體 BHK細胞、Marc-145細胞、含有PRRSV XH-GD骨架的感染性克隆pOKA2BCD為農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點實驗室保存;大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞,購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2主要試劑與儀器 DMEM以及2xMEM胎牛血清,購自GIBCO公司;AclⅠ、NheⅠ內(nèi)切酶,購自Thermo Scientific公司;Platinum pfx DNA聚合酶、TRIZol?Reagent,購自 Invitrogen公司;Cy3標記的山羊抗鼠二抗,購自博奧森生物科技有限公司;N蛋白單抗,購自美國VMRD公司;M-MLV反轉錄試劑盒和熒光定量試劑盒,購自寶生物工程(大連)有限公司。熒光定量儀器,購自美國ABI公司。

1.3突變質(zhì)粒的構建

1.3.1含有突變位點的引物設計 利用Oigo6設計突變氨基酸Y到H的兩對引物,其中第一對擴增A片段上游引物AF序列為5′-TGACTGCCAAAGAACTGGAGAAAC-3′,下游引物AR序列為5′-CTCAGGATTGGACCTGAGTTTTTCCCACATGGA-3′;第二對擴增 B片段上游引物 BF序列為 5′-TCCATGTGGGAAAAACTCAGGTCCAATCCTGAG-3′,下游引物 BR序列為5′-AGATGTTCTGCCCGAACCTCC-3′,該引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.3.2PCR擴增 分別以 pOK-A2BCD質(zhì)粒為模板,以AF和AR為引物擴增A片段,以BF和BR為引物擴增B片段,用DNA純化試劑盒E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit對 PCR 產(chǎn)物進行回收純化,再以回收的純化產(chǎn)物為模板,以AF和BR為引物擴增得到目的片段,用 DNA純化試劑盒E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit對 PCR 產(chǎn)物進行回收純化。

1.3.3目的片段的酶切與連接 將純化的目的片段進行AclⅠ、NheⅠ雙酶切,酶切之后回收,與酶切過的載體連接,4℃過夜,轉到到大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞中,篩選陽性菌,37℃過夜搖菌,提取質(zhì)粒。

1.4病毒的拯救 將含有病毒全長的感染性克隆質(zhì)粒轉染BHK細胞,參照Lipofectamine 2000說明書。24 h之后收獲細胞,反復凍融,命名為P0。將凍融后的細胞離心,用上清感染長滿單層的Marc-145細胞,用血清含量為2%DMEM維持液孵育細胞,48 h之后觀察細胞病變,如有病變,參照同樣的方法繼續(xù)往下傳代,命名為XH-GD-Y642H,代次為P1-P3代。

1.5拯救病毒的PCR鑒定 為了驗證觀測細胞病變非污染親本毒,引入沉默突變FseⅠ酶切位點來進行鑒定,在兩側設計引物進行測定,引物序列:Det-F:5′-CTGAGCTTGGGGTGCTG-3′;Det-R:5′-ATGGCGAATTTCTTTGTACTG-3′。 RNA 提取參照TRIZol?Reagent RNA提取試劑的使用說明書操作,反轉錄參照M-MLV反轉錄酶說明書。將得到的PCR純化產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

1.6拯救病毒的間接免疫熒光鑒定 將拯救病毒第三代以MOI=1的劑量接種Marc-145細胞,感染之后24 h多聚甲醛固定30 min,之后以PRRSV N蛋白單抗為一抗在37℃孵育1 h,PBS清洗3次,之后以1∶200稀釋的cy3標記的山羊抗鼠二抗室溫孵育1 d,最后PBS清洗3次,在熒光顯微鏡下觀察紅色熒光。

1.7拯救病毒的TCID50測定 測定rXH-GD-642第3代病毒和親本毒rXH-GD第3代病毒的滴度。

操作步驟:用rXH-GD-642第3代病毒和親本毒rXH-GD第3代病毒,以MOI=1的劑量感染Marc-145和PAM細胞,分別在48 h采集上清液。采集上清液之后加入等量的含2%胎牛血清的維持液,將取出的樣品進行TCID50測定。

1.8熒光定量測定Nsp9轉錄水平 將前述2種病毒以MOI=1的劑量感染Marc-145細胞,24 h采集細胞,提取RNA,反轉錄,以Nsp9引物進行熒光定量PCR,內(nèi)參為GAPDH,具體參照文獻[16]。

1.9噬斑試驗 將拯救出來的病毒第3代倍比稀釋,感染Marc-145細胞,1 h之后加入終濃度2%胎牛血清和1%瓊脂糖的MEM營養(yǎng)液,48 h后,0.5%結晶紫染色液染色。

1.10數(shù)據(jù)分析 TCID50結果采用GraphPad Prism軟件進行分析,P＜0.05視為差異顯著。

2　結果與分析

2.1含有突變位點質(zhì)粒的構建 以感染性克隆模板質(zhì)粒為模板進行融合 PCR擴增,分別得到了1 500 bp和600 bp左右的A片段和B片段,以上回收的PCR為模板,重新進行新的擴增得到含有突變位點的PCR片段,將該PCR片段進行回收,AclⅠ、NheⅠ雙酶切之后連接之前酶切過的感染性克隆產(chǎn)物,轉化之后進行菌液PCR鑒定陽性質(zhì)粒。將陽性菌液送公司測序,測序結果與預期一致,表明質(zhì)粒構建正確,如圖1所示。

圖1　突變位點峰

2.2替換病毒的拯救與鑒定 轉染之后接種Marc-145細胞,第一代即出現(xiàn)細胞病變,已穩(wěn)定傳至第3代。用鑒別引物進行擴增,得到目的片段,結果見圖2。測序結果表明,仍具有引入的沉默突變,非污染親本毒。

間接免疫熒光試驗結果,可見在兩種拯救病毒感染的細胞上均有紅色可見熒光,進一步表明病毒拯救成功,結果見圖3。

圖2　菌液PCR擴增

2.3拯救病毒的生物學特性 用MOI=1的劑量接種拯救病毒XH-GD-Y642H或親本毒XHGD感染Marc-145細胞和PAM細胞48 h,收集上清進行 TCID50測定。結果表明,rXH-GD-

圖3　兩種拯救病毒免疫熒光實驗結果

Y642H和rXH-GD的滴度差異不明顯,結果見圖4和圖5。

圖4　兩種病毒在Marc-145細胞上的滴度變化

圖5　兩種病毒在PAM的滴度變化

2.4噬斑試驗結果 噬斑試驗結果表明,突變之后的病毒噬斑大小與原病毒相比差異不大,見圖6。

圖6　兩種病毒的噬斑大小

2.5Nsp9轉錄水平 在病毒感染細胞24 h之后,采集樣品進行Nsp9相對表達量的測定,結果表明,突變之后病毒Nsp9的mRNA水平有所下降,差異顯著,見圖7。

圖7　兩種病毒的轉錄水平比較

3　討論

之前的研究結果表明Nsp9主要定位在細胞質(zhì),病毒感染會引起該蛋白向細胞核內(nèi)轉移,并且表達量逐步升高,強弱毒株存在12個氨基酸突變,將弱毒Nsp9替換到強毒感染性克隆上可以提高病毒滴度。基于此項結論,將強毒株的突變位點組氨酸,替換為弱毒株的位點酪氨酸,經(jīng)過病毒拯救之后發(fā)現(xiàn),病毒滴度沒有發(fā)生明顯升高,推測病毒的滴度與第642位氨基酸無顯著關系。本試驗采用的感染性克隆第642位點初始為組氨酸,突變?yōu)槿醵局甑睦野彼?至于突變?yōu)槠渌被崾欠駮绊懖《镜牡味群筒《镜膹椭七€需要進一步的試驗驗證。本試驗結果表明,突變之后病毒粒子的噬斑大小未發(fā)生變化,病毒Nsp9基因的轉錄水平有所下降,分析其原因是由于突變之后改變了病毒蛋白的三級結構,間接影響了病毒非結構蛋白的轉錄。與PRRSV同屬的馬動脈炎病毒(Equine arteritis virus,EAV)、小鼠乳酸脫氫酶升高征病毒(Lactate dehydrogenase elevating virus,LDV)以及猴出血熱病毒(Simian hemorrhagic fevervirus,SHFV)的聚合酶蛋白上,該位點是天門冬氨酸,而不是酪氨酸或者組氨酸,如人工將PRRSV第642位點突變?yōu)樘扉T冬氨酸,是否會導致其他生物學特征產(chǎn)生變化,還需要進一步通過反向遺傳學驗證。

之前有報道在通過反向遺傳學突變的PRRSV其他蛋白(Nsp7、GP5a等),會引起對病毒致死突變或者降低病毒滴度或者轉錄[17],本試驗結果與之前保持一致。據(jù)此推測只要不破壞病毒基因的高級結構就不會造成病毒致死突變。這一點需通過密碼子優(yōu)化方法進行進一步測試并進一步證明關鍵氨基酸的作用及其對病毒生物學特性的影響。

Nsp9不僅與宿主蛋白發(fā)生作用,而且與病毒毒力,耐藥性,IFN-γ等密切相關。已有報道針對Nsp9設計相應的化合物會抑制病毒復制[18-21],PRRSV在全國范圍內(nèi)突變?nèi)找鎳乐?而Nsp9突變較其他基因較保守,這也為未來研究該基因以及控制該病奠定了新的方向。本研究為進一步探索病毒Nsp9的復制機理與調(diào)控機制奠定了基礎。