劉敏芳,曹夢蕊,李榮旭,盧玉葵,陳建紅,陳 煢,許文燁,張濟培

(佛山科學技術學院生命科學院,廣東 佛山 528231)

沙門菌(Salmonella)是腸桿菌科沙門菌屬中一種重要的食源性人獸共患病病原菌。能在人和動物間交叉感染,可致人和動物急性食物中毒、急性胃腸炎、菌血癥和腸外感染等疾病,在醫(yī)學、獸醫(yī)學、公共衛(wèi)生學方面有重要意義[1-2]。一般認為,該病主要危害3周齡以內(nèi)的雛鵝,使之發(fā)生敗血癥、胃腸炎及其他組織局部炎癥的急性感染,在中、成年鵝群呈慢性及隱性感染,無明顯的臨床表征且不致死[3]。近年來,沙門菌危害鵝群的日齡越來越大,可引起成年鵝群生產(chǎn)性能下降并出現(xiàn)急性死亡。有數(shù)據(jù)表明,鼠傷寒沙門菌是家禽感染沙門菌病的優(yōu)勢血清型之一,與其他家禽相比,鵝更容易受到鼠傷寒沙門菌的感染,并且對鼠傷寒沙門菌的抗性隨著年齡的增加而增加[4-5]。因此,本試驗以鼠傷寒沙門菌人工感染8周齡的中年鵝群,對受感染鵝進行臨床癥狀、病理剖檢觀察及顯微病理組織學觀察,初步了解鼠傷寒沙門菌對鵝機體的影響,為臨床診斷鵝沙門菌病及有效防控該病提供參考。

1　材料與方法

1.1菌株來源 源于廣東佛山三水某鵝場病鵝,分離純化鑒定為鼠傷寒沙門菌(O1,O4,O12;Hi;H1,H2)分離株(下簡稱SESM株),甘油凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2試驗動物 1日齡購自非疫區(qū)的健康鵝12只,飼養(yǎng)至8周齡,攻毒試驗前采集肛拭子進行沙門菌分離鑒定,結(jié)果為陰性。

1.3主要試劑與設備 丹麥SSI沙門菌診斷血清(廣州迪景生物有限公司);LB肉湯、RVS增菌肉湯、XLD培養(yǎng)基與沙門菌生化鑒定盒(廣東環(huán)凱生物技術有限公司);T-cycles PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司產(chǎn)品)。

1.4菌懸液的制備 釣取SESM株單個菌落,接種于8 mL LB液體培養(yǎng)基中,37℃,200 r/min,培養(yǎng)20 h,制備濃度約為5×107CFU/mL的菌懸液。

1.5動物分組處理 隨機將8周齡試驗鵝分為試驗組與對照組,每組6只。試驗組每只鵝經(jīng)肌肉注射鼠傷寒沙門菌懸液各0.5 mL,對照組每只鵝肌肉注射生理鹽水各0.5 mL,隔離飼養(yǎng)。

1.6動物觀察與病料處理 連續(xù)觀察14 d,記錄鵝的精神狀況、食欲、活動、糞便等臨床變化以及發(fā)病和死亡情況,并對感染發(fā)病鵝進行細菌的分離鑒定,觀察主要組織器官的病理變化,并采取其病變的心臟、肝臟、脾臟、腎臟、胰腺和腸道放置于10%甲醛溶液固定液固定48 h以上,制作病理組織石蠟切片,觀察組織學病理變化。

我們知道，無論哪一種中波發(fā)射天線，對于不同的工作頻率，其輸入阻抗是不同的，如果在天線饋點上的阻抗差異太大，會給共塔網(wǎng)絡的設計帶來困難，因此，必須在兩個或多個共塔頻率的饋點上加裝平衡網(wǎng)絡——預調(diào)網(wǎng)絡，預調(diào)網(wǎng)不僅能夠平衡饋點上各頻率的阻抗，還能起到防雷和減少功率損耗的作用，因此也就減小了網(wǎng)絡設計難度。圖1中L0、C0是兩個預調(diào)網(wǎng)絡元件。

2　結(jié)果

2.1人工感染鵝的臨床癥狀 試驗鵝感染6 h后開始精神沉郁,扎堆,拉白色稀糞(見中插彩版圖1);12 h后出現(xiàn)以震顫為主的神經(jīng)紊亂癥狀,食欲減退甚至廢絕,羽毛潮濕,軟腳及繼續(xù)拉水樣白色稀糞;18 h后開始出現(xiàn)死亡,于48 h內(nèi)死亡4只鵝;5 d后2只存活鵝明顯消瘦,但精神食欲好轉(zhuǎn),逐步恢復正常;對照組動物無感染發(fā)病與死亡情況。

2.2人工感染鵝的病理變化 發(fā)病鵝的剖檢病理變化均為皮下肌肉呈彌漫性出血,氣囊壁渾濁,呈樹枝狀充血(見中插彩版圖2);心外膜充血、心肌可見芝麻大小的出血斑點(見中插彩版圖3);肝可見充血與針尖狀出血點,表面有大量不規(guī)則的灰白色雪花狀壞死灶(見中插彩版圖4);膽汁充盈、呈墨綠色濃稠樣;脾臟腫大,呈暗紅色充血,可見芝麻大小的灰白色壞死點;肺輕微出血、水腫;腎臟腫大,呈暗紅色斑塊狀出血;腦組織輕微腫脹,可見少量組織液滲出,呈樹枝狀充血(見中插彩版圖5);胰腺腫大、表面布滿針尖狀出血點;腸系膜脂肪可見芝麻大小的出血斑;消化道黏膜以彌漫性充血、出血為主,腺胃乳頭可見多量出血斑點、肌胃角質(zhì)層易剝離,腸道內(nèi)充滿粥樣內(nèi)容物,十二指腸與空腸黏膜彌漫性出血呈紅布樣(見中插彩版圖6),回腸黏膜彌漫性出血,淋巴結(jié)腫大、出血,盲腸與直腸黏膜彌漫性出血較輕,卵巢與睪丸充血、出血等。對照組鵝剖檢未見眼觀異常。

2.3人工感染鵝的病理組織學觀察 顯微組織學觀察可見,感染鵝的心臟、肝、脾、肺、腎、腦、胰腺和腸道等組織與細胞均有不同程度的充血與出血、變性與壞死。心肌纖維排列紊亂、甚至斷裂,心肌纖維間可見大量紅細胞和炎性細胞(見中插彩版圖7)。肝細胞變性、細胞質(zhì)可見大小不一的空泡,部分肝細胞壞死形成大小不一的壞死灶,壞死灶內(nèi)可見淋巴細胞、異嗜性粒細胞與壞死崩解肝細胞(見中插彩版圖8);肝血竇擴張、充滿紅細胞;門管區(qū)可見多量淋巴細胞和異嗜性粒細胞(見中插彩版圖9)。脾白髓結(jié)構疏松,網(wǎng)狀細胞數(shù)量增多,淋巴細胞變性壞死、數(shù)量減少、可見大量的核碎片及細胞殘留的支架并可見少量紅細胞(見中插彩版圖10);紅髓堆積多量紅細胞、網(wǎng)狀細胞數(shù)量增多。三級支氣管、肺房、肺毛細血管、肺間質(zhì)可見少量紅細胞與少量炎性細胞浸潤。腎小管上皮細胞腫脹、變性壞死,腎間質(zhì)可見多量紅細胞;腎小球充滿紅細胞;腎間質(zhì)可見大量紅細胞浸潤(見中插彩版圖11)。腦充血、水腫、毛細血管與小靜脈擴張充血、周圍間隙明顯增寬(見中插彩版圖12);部分神經(jīng)元變性壞死,可見噬神經(jīng)元現(xiàn)象,血管擴張充血、形成淋巴細胞管套(見中插彩版圖13);胰腺的胰島細胞數(shù)量減少、部分細胞胞核固縮、變性壞死,間隙有大量紅細胞浸潤;腸黏膜上皮細胞變性壞死、大量脫落,固有層、黏膜下層、肌層可見大量紅細胞和以淋巴細胞為主的炎性細胞浸潤(見中插彩版圖14)。

對照組鵝心肌纖維呈螺旋狀排列,可見縱、橫、斜等不同切面,縱切面可見橫紋和閏盤;肝組織的肝小葉分界不清,肝細胞呈錐體形,細胞核大而圓,肝血竇中有個別紅細胞;脾白髓由密集的淋巴細胞環(huán)繞動脈組成,呈圓形、藍紫色和致密淋巴組織團塊,散布于紅髓中。三級支氣管、肺房中無漿液、紅細胞等雜質(zhì),肺房呈不規(guī)則空囊腔;腎小管由立方形或錐體形上皮細胞組成,胞質(zhì)強嗜酸性,細胞界限不清;神經(jīng)元胞核大而圓、著色淡,有多個樹突;空腸黏膜絨毛完整,皺襞發(fā)達,指狀、杯狀細胞多,固有層有少量孤立淋巴小結(jié);胰腺的胰島細胞排列成團索狀,細胞之間有豐富的毛細血管。

2.4分離鑒定結(jié)果 將分離的6株分離株培養(yǎng)物進行生化鑒定、血清型鑒定、PCR鑒定。生化鑒定結(jié)果符合沙門菌的生化特性;血清型分型為鼠傷寒沙門菌(O1,O4,O12;Hi;H1,H2);PCR鑒定根據(jù)invE基因設計引物,條帶大小約為279 bp。結(jié)果顯示SESM株、分離株與預期片段一致(圖15)。

圖15　SESM株、分離株的invE基因PCR擴增結(jié)果

3　分析與討論

沙門菌病是危害養(yǎng)殖業(yè)的主要病原菌之一。目前對于禽類(雞、鴨、鵝),已有的沙門菌如雞白痢沙門菌、腸炎沙門菌、鴨沙門菌等感染的病理組織學變化的報道,但鵝群感染鼠傷寒沙門菌引起的顯微病理組織學變化鮮有報道[6]。不同沙門菌血清型引起動物體的癥狀與病變并不完全一致,受感染動物的主要臟器的病理組織學變化也應各有其特點,故很有必要加以研究分析鵝群感染鼠傷寒沙門菌模型,以進一步明確其致病危害性質(zhì),豐富診斷理論依據(jù)。

本試驗結(jié)果明確了鵝感染鼠傷寒沙門菌的癥狀與危害。可見被感染鵝拉水樣白色稀糞、消瘦、震顫等臨床癥狀,表明鼠傷寒沙門菌可侵害消化道與中樞神經(jīng),并影響機體的生長發(fā)育,這與成建[7]、金海林[8]等人的關于雛鵝沙門菌病的臨床癥狀報道基本一致。試驗鵝感染6 h后開始出現(xiàn)臨床癥狀,18 h后出現(xiàn)死亡,與顏彬[9]試驗中的腸炎沙門菌人工感染鴨24 h才出現(xiàn)臨床癥狀,72 h開始出現(xiàn)死亡的結(jié)果有所區(qū)別,與曾靜靜[6]試驗中的鴨沙門菌人工感染鴨7 d均未死亡的結(jié)果亦有所區(qū)別,說明不同沙門菌血清型引起動物體的感染、致死性并不完全一致,鼠傷寒沙門菌是強致病性沙門菌,對水禽的危害更大。

本試驗結(jié)果明確了鵝感染鼠傷寒沙門菌的大體組織學變化。光學顯微鏡下可見感染鵝心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦與腸道等多組織器官大量紅細胞和以異嗜性粒細胞、淋巴細胞為主的炎性細胞浸潤,實質(zhì)細胞變性壞死,并以消化器官的細胞損傷最為嚴重。這些顯微病理組織學變化與剖檢中充血、出血、壞死等病變特征密切相關。Barbosa[12]的研究發(fā)現(xiàn),沙門菌可引起雞多組織器官不同時期的淋巴樣反應,尤其是肝臟與腸道的淋巴樣反應更為強烈,解釋了炎性細胞浸潤的現(xiàn)象。

由上述感染模型推測,鼠傷寒沙門菌感染鵝的病理過程與機理為:病原經(jīng)肌肉注射進入組織,通過組織液進入毛細血管網(wǎng)與淋巴液中,發(fā)病早期引起菌血癥,主要侵害消化道引起局部微絨毛細胞變性、黏膜固有層充血、水腫和點狀出血等腸道炎癥反應;隨著血液循環(huán)快速繁殖并產(chǎn)生大量毒素,進入肝臟、肺臟、脾臟、腎臟等組織器官造成不同程度地病理損傷及其細胞變性壞死引發(fā)敗血癥,并突破血腦屏障進入中樞神經(jīng)引起神經(jīng)癥狀,最終引起鵝的死亡。鼠傷寒沙門菌感染鵝群后,既可垂直傳播也可水平傳播,加之鵝群“水陸”結(jié)合的高密度養(yǎng)殖模式,使防控更為困難,給養(yǎng)鵝業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失;同時本病原對公共衛(wèi)生安全也具有潛在的危害,威脅人類的健康,建議進一步加強研究與診斷防控。