原梨萍1，肖靜2，王瑞明2，路福平1*，汪俊卿2，李玉1

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457；2.齊魯工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院山東省微生物酶技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南250353）

克勞氏芽孢桿菌（Bacillus clausii）是一類好氧型、內(nèi)生抗逆孢子的革蘭氏陽(yáng)性菌，具有很好的耐受性，能在極端環(huán)境下生長(zhǎng)。近年來(lái)，芽孢形成及萌發(fā)過(guò)程中關(guān)鍵基因的研究[1-2]備受青睞，而克勞氏芽孢桿菌由于其生理特性及基因信息不明確，使其在芽孢方面的研究及工業(yè)上的應(yīng)用較為落后。目前，國(guó)內(nèi)外科研人員以模式微生物枯草芽孢桿菌為主對(duì)芽孢形成過(guò)程及關(guān)鍵基因的調(diào)控做了大量深入的研究[3-7]，其中，以Spo0A、sigma因子及五種磷酸激酶基因的研究居多[8-13]。芽孢的生成是一個(gè)多層次分階段的過(guò)程，其中Spo0A是細(xì)胞從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期進(jìn)入芽孢形成時(shí)期的關(guān)鍵應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白（responseregulatorprotein，RSP），Spo0A-PO4通過(guò)結(jié)合到基因“OA-box”序列上可調(diào)節(jié)500多種基因的表達(dá)。

目前國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，spo0A基因缺失對(duì)枯草芽孢桿菌、梭狀芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌等多種芽孢桿菌的芽孢生成均產(chǎn)生有效的抑制作用[14-16]，而且該基因一定程度上影響菌體生物量及代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，SANDOVAL N R[17]敲除梭狀芽孢桿菌spo0A基因后不僅對(duì)芽孢生成產(chǎn)生影響，而且有效提高了菌體生物量及丁醇產(chǎn)量。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于spo0A基因缺失影響淀粉酶產(chǎn)量的報(bào)道少見。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)基因敲除技術(shù)構(gòu)建spo0A基因缺失菌株，研究發(fā)現(xiàn)spo0A基因的缺失對(duì)菌體生物量、芽孢生成率及淀粉酶活力均產(chǎn)生影響，該基因在菌種改良上可以作為提高淀粉酶產(chǎn)量的靶點(diǎn)，對(duì)后續(xù)芽孢缺失型工業(yè)生產(chǎn)菌株的構(gòu)建具有重要意義，為酶工業(yè)遺傳育種提供了新的選擇，也為高產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌工程菌株的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株及質(zhì)粒

克勞氏芽孢桿菌（Bacillus clausii）QL-1、含pHT01質(zhì)粒的大腸桿菌（Escherichia coli）JM109：山東省微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑

限制性核酸內(nèi)切酶：日本TakaRa寶生物公司；氯霉素、Ezup柱式基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）抽提試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒：生工生物工程（上海）有限公司；高純度質(zhì)粒小量快速抽提試劑盒：北京艾德萊生物科技有限公司；其他試劑均屬于國(guó)產(chǎn)分析純。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：酵母浸粉5g/L、蛋白胨10g/L、氯化鈉10g/L、pH 7.0。

可溶性淀粉培養(yǎng)基：牛肉膏5 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化鈉5 g/L、可溶性淀粉 2 g/L、pH 7.0～7.2、瓊脂20 g/L。

菌體增殖培養(yǎng)基：酵母浸粉5 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化鈉10 g/L、山梨醇91 g/L。

菌體復(fù)蘇培養(yǎng)基：酵母浸粉5 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化鈉10 g/L、山梨醇69 g/L、甘露醇91 g/L。

上述培養(yǎng)基均于121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；WFJ7200型可見分光光度計(jì)：尤尼柯（上海）儀器有限公司；4380C型電轉(zhuǎn)儀、5804R低溫冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；GNP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Veriti96孔熱循環(huán)梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；MD2000核酸超微量分光光度計(jì)：美國(guó)BioFure公司；ZQYZ-CS型恒溫振蕩培養(yǎng)箱：上海知楚儀器有限公司；DYY-12電泳儀：北京市六一儀器廠；UVI Essential V6凝膠成像儀：英國(guó)Uvitec公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì)

采用Oligo軟件設(shè)計(jì)引物，引物見表1。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用引物Table 1 Primers used in the study

1.3.2 同源重組片段spo0A-Cmr的制備

同源重組片段spo0A-Cmr的制備流程見圖1。

圖1 重組菌B.clausii QL-1△spo0A構(gòu)建流程圖Fig.1 Flowchart of construction of recombinant strain B.clausii QL-1△spo0A

spo0A基因的調(diào)?。禾羧.clausiiQL-1單菌落轉(zhuǎn)接于50 mL LB液體培養(yǎng)基，37℃，200 r/min培養(yǎng)12 h，使用Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒對(duì)B.clausiiQL-1菌體基因組進(jìn)行提取。1 μL基因組模板、1 μLspo0AF和1 μLspo0AR引物、12.5μL2×HiFi-PCRmaster、9.5μLddH2O組成的25μL反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得堿基長(zhǎng)度為418bp的spo0A基因片段，PCR擴(kuò)增條件為：（1）95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)；（2）72 ℃再延伸10 min，4℃保存。

片段Cmr基因的調(diào)?。禾羧〈竽c桿菌JM109單菌落轉(zhuǎn)接于50 mL LB液體培養(yǎng)基，37℃，200 r/min培養(yǎng)12 h，使用高純度質(zhì)粒小量提取試劑盒提取pHT01質(zhì)粒。1μLpHT01質(zhì)粒模版、1 μLCmrF和1 μLCmrR引物、12.5 μL2×HiFi-PCR master、9.5 μL ddH2O組成的25 μL反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得長(zhǎng)度為1264bp的Cmr抗性基因片段，PCR擴(kuò)增條件為：（1）95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸2min35s，30個(gè)循環(huán)；（2）72℃再延伸10min，4℃保存。

同源重組片段spo0A-Cmr的制備：使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒回收所得的spo0A基因片段和Cmr抗性基因片段，首先進(jìn)行第一步重疊PCR，2μLspo0A基因片段和2μLCmr抗性基因片段互為模板及引物、12.5 μL 2×HiFi-PCR master及3.5 μL ddH2O組成的25 μL反應(yīng)體系進(jìn)行重疊PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件為：（1）95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸2 min 35 s，8個(gè)循環(huán)；向第一步反應(yīng)液中加入1 μLspo0AF和1 μLCmrR引物、12.5 μL 2×HiFi-PCR master及10.5 μL ddH2O進(jìn)行第二步大量擴(kuò)增PCR，PCR擴(kuò)增條件為：（1）95℃預(yù)變性5min；95℃變性30 s，58℃退火30 s，72 ℃延伸3 min 30 s，30個(gè)循環(huán)；（2）72℃再延伸10 min，4℃保存。經(jīng)過(guò)上述兩步重疊延伸PCR擴(kuò)增得到1648bp的同源重組片段spo0A-Cmr。使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒回收所得的spo0A-Cmr片段，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 同源重組片段spo0A-Cmr回收產(chǎn)物的酶切及濃縮

采用限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ對(duì)所得的spo0A-Cmr片段進(jìn)行酶切，30 μL酶切體系為：25 μL PCR產(chǎn)物、1.5 μLBamHⅠ、3.5 μL 10×K Buffer，37 ℃靜置1.5 h。向酶切產(chǎn)物中加入醋酸鈉（1/10體積，3mol/L）和無(wú)水乙醇（25倍體積），混合后-20℃處理20 min，12 000 r/min離心8 min得DNA沉淀；加入體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇重懸DNA沉淀，12 000 r/mim離心8 min，除去乙醇，37℃風(fēng)干，加入ddH2O重懸，制得300-500 ng/μL的spo0A-Cmr濃縮DNA溶液。

1.3.4 克勞氏芽孢桿菌B.clausiiQL-1感受態(tài)的制備

電轉(zhuǎn)緩沖液配制：山梨醇91 g/L、甘露醇91 g/L、甘油100 g/L。

將B.ClausiiQL-1單菌落接種于15 mL的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h；將上述菌液以2%接種量轉(zhuǎn)接到50 mL LB培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600nm值為1.0；4 ℃、8 000 r/min離心8 min收集菌體；電轉(zhuǎn)緩沖液洗滌3～4次后重懸、分裝，即為制備好的感受態(tài)。感受態(tài)制備過(guò)程中均保證4℃條件下操作。

1.3.5 重組菌B.clausiiQL-1△spo0A的構(gòu)建

25 mg/mL氯霉素的制備：準(zhǔn)確稱取氯霉素溶解于無(wú)水乙醇，溶解后過(guò)0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌，分裝后于-20℃中保存。

感受態(tài)與spo0A-Cmr濃縮片段以10∶1（V/V）比例混合，1500V、5ms條件下進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，立即加入1 mL的菌體復(fù)蘇培養(yǎng)基，37℃，180 r/min復(fù)蘇4～5 h后涂布于氯霉素終質(zhì)量濃度為25 μg/mL的LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)18～24 h，篩選具有氯霉素抗性菌株。

1.3.6 陽(yáng)性重組菌株的鑒定

以提取到的陽(yáng)性菌株DNA為模板，spo0AF和CmrR為引物PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，最終獲得陽(yáng)性重組菌株B.clausiiQL-1△spo0A。B.clausiiQL-1△spo0A重組菌于LB液體培養(yǎng)基中，在37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)條件下傳代15次，進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)。

1.3.7 出發(fā)菌株及重組菌株芽孢形成檢測(cè)

將菌株B.clausiiQL-1與B.clausiiQL-1△spo0A分別以2%接種量接種于LB液體培養(yǎng)基，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)28 h，將菌液于80℃水浴處理10 min。將80℃水浴處理過(guò)的出發(fā)菌株菌液稀釋10-6倍、重組菌株菌液不稀釋，同樣分別做三個(gè)平行，取100 μL涂布于LB固體平板上，將未處理的出發(fā)菌株及重組菌株的菌液分別稀釋10-6倍，做3個(gè)平行，取100 μL涂布于LB固體平板上，上述平板放置于37℃培養(yǎng)12～18 h，用平板計(jì)數(shù)法觀察并清點(diǎn)100 μL處理菌液及未處理菌液的芽孢數(shù)及菌體數(shù)（CFU/mL）。芽孢生成率計(jì)算公式如下：

1.3.8B.clausiiQL-1△spo0A重組菌生長(zhǎng)曲線及干質(zhì)量的測(cè)定

生長(zhǎng)曲線的繪制：挑取菌株B.clausiiQL-1與B.clausiiQL-1△spo0A單菌落于15mLLB液體培養(yǎng)基，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)12h，將菌液轉(zhuǎn)接至100 mLLB液體培養(yǎng)基至初始OD600nm值為0.1左右，繼續(xù)培養(yǎng)，每隔4 h取樣4 mL，使用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定吸光光度值。

干質(zhì)量的測(cè)定：每隔12 h取樣10 mL，離心得菌體沉淀，于70℃烘箱烘干至恒質(zhì)量后測(cè)其干質(zhì)量。

1.3.9B.clausiiQL-1△spo0A重組菌淀粉酶酶活的測(cè)定

分別將出發(fā)菌株B.clausiiQL-1和重組菌株B.clausiiQL-1△spo0A單菌落點(diǎn)涂于可溶性淀粉平板中央，于37℃條件下靜置培養(yǎng)36 h，觀察并比較透明圈大小。分別以2%接種量接種在LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔6 h取樣5 mL，4℃、12 000 r/min離心8 min取上清，按照國(guó)標(biāo)GB/T 24401—2009《α-淀粉酶制劑》中所示方法測(cè)定淀粉酶酶活，并按干質(zhì)量進(jìn)行換算為U/g。

淀粉酶酶活定義：于60℃，pH為6.0條件下，1 h液化1 g可溶性淀粉的酶量，即為一個(gè)酶活力單位（U/g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 spo0A基因缺失菌株B.clausiiQL-1△spo0A的構(gòu)建

以B.clausiiQL-1出發(fā)菌基因組為模板，spo0AF和spo0AR為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見圖2a。由圖2a可知，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為500 bp左右，與理論長(zhǎng)度418 bp相符，說(shuō)明成功獲得spo0A片段；以質(zhì)粒pHT01為模板，CmrF和CmrR為引物PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見圖2b。由圖2b可知，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1000bp左右，與理論長(zhǎng)度1 264 bp相符，說(shuō)明成功獲得抗性基因Cmr片段；以膠回收所得的spo0A片段和Cmr片段為模板，spo0AF和CmrR為引物進(jìn)行重疊延伸PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見圖2c。由圖2c可知，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1 500 bp左右，與理論長(zhǎng)度1 648 bp相符，說(shuō)明成功獲得同源重組片段spo0A-Cmr。將spo0A-Cmr片段經(jīng)BamHⅠ酶切后進(jìn)行濃縮，測(cè)其質(zhì)量濃度為450 ng/μL。將10 μL回收片段與100 μL的B.clausii感受態(tài)混合進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，涂布于氯霉素抗性LB平板上，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，以spo0AF和CmrR為引物進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見圖2d。由圖2d可知，出現(xiàn)特異性目的條帶，表明成功獲得B.clausiiQL-1△spo0A重組菌。

圖2 spo0A-Cmr片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及菌落PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.2 Electrophoresis of PCR amplified products of spo0A-cmr and colony

通過(guò)連續(xù)傳代15次，以CmrF和CmrR為引物進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見圖3。由圖3可知，得到擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1 000 bp左右，與理論長(zhǎng)度1 264 bp相符，說(shuō)明B.clausiiQL-1△spo0A成功導(dǎo)入Cmr抗性基因，以spo0AF和CmrR為引物得到的擴(kuò)增產(chǎn)物大小同樣于1648bp出現(xiàn)特異性目的條帶，表明重組菌株遺傳穩(wěn)定性較好。

圖3 B.clausii QL-1△spo0A重組菌株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.3 Electrophoresis of PCR amplified products of B.clausii QL-1△spo0A

2.2 spo0A基因缺失克勞氏芽孢桿菌對(duì)芽孢萌發(fā)的影響

圖4 spo0A基因缺失對(duì)克勞氏芽孢桿菌芽孢萌發(fā)的影響Fig.4 Effect of spo0A gene knockout on spore germination of Bacillus clausii

通過(guò)平板計(jì)數(shù)法對(duì)出發(fā)菌株及重組菌株芽孢生成情況進(jìn)行計(jì)算及比較，結(jié)果見圖4。由圖4可知，菌株B.clausiiQL-1芽孢萌發(fā)數(shù)為3.93×108CFU/mL，菌體數(shù)為4.67×108CFU/mL，計(jì)算得到出發(fā)菌株B.clausiiQL-1芽孢生成率約為84.15%，通過(guò)平板計(jì)數(shù)法及顯微鏡觀察，B.clausiiQL-1△spo0A均不生成芽孢。結(jié)果表明，spo0A基因是克勞氏芽孢桿菌芽孢萌發(fā)過(guò)程中的關(guān)鍵基因。

2.3 spo0A基因缺失克勞氏芽孢桿菌對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

對(duì)出發(fā)菌株B.clausiiQL-1及重組菌株B.clausiiQL-1△spo0A進(jìn)行了生長(zhǎng)規(guī)律分析及干質(zhì)量測(cè)定，結(jié)果見圖5。

圖5 spo0A基因缺失對(duì)菌株在LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)周期（a）及干質(zhì)量（b）的影響Fig.5 Effects of spo0A gene knockout on the growth cycle（a）and dry mass（b）of strain in LB medium

由圖5a可知，B.clausiiQL-1△spo0A菌株與出發(fā)菌株的生長(zhǎng)周期基本保持一致，4～18h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，18～28 h為穩(wěn)定期，28 h后進(jìn)入衰亡期。由圖5b可知，在任何時(shí)間段，重組菌株B.clausiiQL-1△spo0A生物量均高于出發(fā)菌株B.clausiiQL-1，且均在20 h出現(xiàn)最大生物量，分別為3.10 mg/mL、2.50 mg/mL，生物量提高了24%。

2.4 spo0A基因缺失克勞氏芽孢桿菌對(duì)淀粉酶分泌的影響

可溶性淀粉平板初篩，重組菌株B.clausiiQL-1△spo0A較出發(fā)菌株B.clausiiQL-1透明圈增大，重組菌株透明圈與菌落直徑比為2.75，出發(fā)菌株透明圈與菌落直徑比為1.31，說(shuō)明構(gòu)建菌株較出發(fā)菌株水解淀粉能力更強(qiáng)。進(jìn)一步于LB液體培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)并測(cè)定淀粉酶酶活，結(jié)果見圖6。由圖6可知，B.clausiiQL-1△spo0A產(chǎn)淀粉能力高于B.clausiiQL-1菌株，且發(fā)酵至72 h時(shí)，淀粉酶酶活均達(dá)到最高，分別為1.58×105U/g、0.86×105U/g，較出發(fā)菌株B.clausiiQL-1，B.clausiiQL-1△spo0A菌株淀粉酶酶活提高83.72%。

圖6 spo0A基因缺失對(duì)淀粉酶酶活的影響Fig.6 Effect of gene knockout on amylase activities

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)同源單交換技術(shù)成功實(shí)現(xiàn)了克勞氏芽孢桿菌spo0A基因的敲除，構(gòu)建了spo0A基因缺失型菌株B.clausiiQL-1△spo0A，并對(duì)其發(fā)酵性能進(jìn)行初步研究，發(fā)現(xiàn)spo0A基因缺失型菌株不生成芽孢，且較出發(fā)菌株B.clausiiQL-1生物量提高24%，表明spo0A基因不僅是克勞氏芽孢桿菌芽孢形成關(guān)鍵基因，而且也是菌株生長(zhǎng)的重要基因，為構(gòu)建芽孢缺失型克勞氏芽胞桿菌工業(yè)生產(chǎn)菌株奠定了基礎(chǔ)。通過(guò)對(duì)B.clausiiQL-1△spo0A菌株的進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)B.clausiiQL-1△spo0A菌株較出發(fā)菌株B.clausiiQL-1淀粉酶酶活提高83.72%，表明spo0A基因也是克勞氏芽孢桿菌淀粉酶生成的重要相關(guān)基因，該發(fā)現(xiàn)對(duì)高產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌類微生物的構(gòu)建具有指導(dǎo)意義。

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