李 慧，陳歷水*，劉 洋，何 景，劉 蕾，張連慧，楊海鶯

（中糧營養(yǎng)健康研究院 老年營養(yǎng)食品研究北京市工程實驗室，北京 102209）

黃酒是以稻米、黍米等為主要原料，經(jīng)蒸煮、加曲、糖化、發(fā)酵、壓榨、過濾、煎酒、貯存、勾兌而成的釀造酒。釀造黃酒煎酒灌壇后，要經(jīng)過一定時間的貯存，以增加香氣和提高酒的醇厚感、協(xié)調(diào)性和增加酒體的穩(wěn)定性[1]。

由于黃酒是多菌種參與的開放式釀造低度酒，富含營養(yǎng)物質(zhì)和氨基酸，是微生物的良好培養(yǎng)基，因此，貯存期成為了污染微生物繁殖的最佳時期[2]。尤其在黃酒生產(chǎn)過程中，生產(chǎn)工具及貯藏容器消毒不過關(guān)，生產(chǎn)原料、生產(chǎn)用水微生物污染，煎酒工藝處理不徹底，貯藏環(huán)境控制不嚴(yán)格，貯藏時發(fā)生漏壇等都可以造成污染菌的引入[3-4]。

造成黃酒陳釀變質(zhì)的污染微生物，包括芽孢菌、霉菌、酵母、乳酸菌及其他細(xì)菌[5]，這些污染菌對黃酒的品質(zhì)及安全將會造成嚴(yán)重影響。謝廣發(fā)等[6]對酸敗袋裝黃酒中污染微生物進(jìn)行檢測和分析，確認(rèn)污染菌主要有假單胞菌屬，占總克隆數(shù)的92.3%，其次為無色桿菌屬，占總克隆數(shù)的7.7%。TERASAKI M等[7]也在日本清酒中分離出假單胞菌屬細(xì)菌。章銀珠等[8]從變質(zhì)傳統(tǒng)發(fā)酵陳化黃酒中分離了5株乳酸桿菌，4株酵母（分別是酵母屬、漢遜氏酵母屬、球擬酵母屬和畢赤酵母屬）和4株霉菌（分別是1株曲霉、2株青霉和1株側(cè)孢霉），這些微生物是引起陳化黃酒變質(zhì)的主要原因。KIM S A等[9]在韓國米酒中分離出蠟樣芽孢桿菌，認(rèn)為污染了這種條件致病菌的米酒具有潛在的食品安全風(fēng)險。章志超等[10]利用形態(tài)學(xué)觀察、生理生化和分子生物學(xué)手段從酸敗黃酒中分離出食果糖乳桿菌，為評估黃酒酸敗嚴(yán)重程度及解決相關(guān)食品安全問題提供了參考方法。

本研究針對性的選擇并優(yōu)化分離條件，采用形態(tài)學(xué)觀察、生理生化鑒定和分子生物學(xué)法對分離純化的污染微生物進(jìn)行菌種鑒定，以期為有效控制或者降低壇酒霉變的概率提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

黃酒及黃酒污染物樣品：浙江某酒廠倉庫貯藏壇酒（壇外表面有明顯污染）。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯-葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基、孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂、MRS培養(yǎng)基、MC培養(yǎng)基、革蘭氏染色液、細(xì)菌芽孢染色液：北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.1.3 化學(xué)試劑

酵母基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）提取試劑盒（DP307）、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（DP302）、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物純化試劑盒：天根生化科技有限公司；脫氧核糖核苷三磷酸deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）、Taq酶（5 U/μL）及Buffer：寶生物工程（大連）有限公司；引物：英濰捷基上海貿(mào)易有限公司合成；VITEC GN卡、GP卡、YST卡、API 50 CHB/E試劑盒：法國梅里埃公司。

1.2 儀器與設(shè)備

IPP260低溫培養(yǎng)箱：德國Memmert公司；ATBTM New ATB自動微生物鑒定系統(tǒng)、VITEK 2 Compact全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)：法國梅里埃公司；Scope A1正置相差顯微鏡：德國ZEISS公司；SQ510C立式壓力蒸汽滅菌器：日本YAMATO公司；Mini-Beadbeater-16研磨珠均質(zhì)器：美國Biospec公司；Veriti梯度PCR儀：美國LifeTechnologies公司；Nano Drop 2000超微量分光光度計：美國Thermo Fisher公司；XR System凝膠成像系統(tǒng)：美國Bio-Rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 污染菌種的分離和純化

將黃酒10倍梯度稀釋至10-6。另取壇底沉淀物25 g，置于盛有225 mL磷酸鹽緩沖液的無菌均質(zhì)袋中，拍擊式均質(zhì)器拍打1～2 min，制成1∶10的樣品勻液，然后將此樣品進(jìn)行10倍梯度稀釋至10-6。取各梯度稀釋樣品勻液1 mL于無菌平板中，將15～20 mL冷卻至46℃的孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂、MRS培養(yǎng)基、MC培養(yǎng)基傾注平皿，并轉(zhuǎn)動平皿使其混合均勻。

孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基倒置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中需氧培養(yǎng)3～5d。營養(yǎng)瓊脂、MRS培養(yǎng)基、MC培養(yǎng)基倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中分別需氧和厭氧培養(yǎng)2～3 d。根據(jù)菌落生長形態(tài)，大小及顏色的不同，挑選不同的單菌落接種于相應(yīng)的固體培養(yǎng)基中進(jìn)行純化，直至得到單一微生物。

1.3.2 形態(tài)學(xué)觀察

將分離得到的細(xì)菌分別在營養(yǎng)瓊脂、MRS瓊脂、MC瓊脂上進(jìn)行劃線，于37℃條件下需氧和厭氧培養(yǎng)24 h后觀察菌落生長情況及菌落形態(tài)，通過革蘭氏染色、顯微鏡觀察菌體形態(tài)。將分離得到的真菌在PDA培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基上三點接種，于28℃條件下培養(yǎng)3～5 d后觀察菌落生長情況及菌落形態(tài)并鏡檢。

1.3.3 生理生化鑒定

細(xì)菌：挑取平板的單菌落，使用法國生物梅里埃公司VITECGN卡、GP卡，芽孢菌鑒定使用API50 CHB/E進(jìn)行直接鑒定。

真菌：酵母樣真菌使用法國生物梅里埃公司YST卡進(jìn)行鑒定。

1.3.4 分子生物學(xué)鑒定

（1）細(xì)菌的分子生物學(xué)鑒定

挑取細(xì)菌平板和乳酸菌平板上的單菌落分別接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基和MRS培養(yǎng)基中，37℃過夜。取1 mL菌液12000r/min離心10min后，棄去上清，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組的說明書規(guī)定操作，所得的基因組用超微量紫外分光光度計檢測濃度和純度。

16S rDNA序列擴(kuò)增所用引物，正向引物為27F：5′-AG AGCCTGGCTCAGTTTGAT-3′；反向引物為1492R：5′-GG TTACCTTGTTACGACTT-3′[11-12]。

PCR反應(yīng)體系（30μL）：ddH2O 19.2μL、10×Buffer3 μL、dNTPs 2.5 μL、引物各1.5 μL、Taq酶0.3 μL、所提取的基因組2 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性30 s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環(huán)；72℃再延伸10min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠（1%）電泳檢測。

將電泳檢測后的PCR產(chǎn)物送至英濰捷基上海貿(mào)易有限公司進(jìn)行測序，獲得16S rRNA基因序列。測序結(jié)果在美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）的GenBank中進(jìn)行基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）分析比對。

（2）真菌的分子生物學(xué)鑒定

挑取絲狀真菌平板上的菌絲于20 mL的PDA液體培養(yǎng)基，在28℃恒溫?fù)u床中200 r/min振蕩培養(yǎng)3 d。12 000 r/min離心10 min后，棄去上清，按照酵母基因組DNA提取試劑盒提取基因組的說明書規(guī)定操作，所得的基因組用超微量紫外分光光度計檢測濃度和純度。

擴(kuò)增所用引物序列參照李慧等[13-14]的研究（見表1）。PCR反應(yīng)體系和PCR反應(yīng)條件同方法1.3.4，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 真菌基因擴(kuò)增引物序列Table 1 Primer sequence of fungi gene amplification

將電泳檢測后的PCR產(chǎn)物送至英濰捷基上海貿(mào)易有限公司進(jìn)行測序，獲得18S rRNA和ITS基因序列。測序結(jié)果在NCBI的GenBank中進(jìn)行BLAST分析比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌的鑒定

2.1.1 細(xì)菌的菌落及菌體形態(tài)分析

通過對污染黃酒及其沉淀物中的細(xì)菌進(jìn)行分離、簡單形態(tài)學(xué)比對后得到3株不同形態(tài)的細(xì)菌，依次編號為B001、B002和B003。其中菌株B001和B002在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上（36±1）℃需氧培養(yǎng)48 h后，菌株B001的菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)分別見圖1中的001-1、001-2，菌落呈乳白色、圓形、扁平、不透明、邊緣不整齊，有芽孢，芽孢橢圓形；菌株B002的菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)見圖1中的002-1、002-2，培養(yǎng)24 h時，菌落藍(lán)綠色圓形，培養(yǎng)48 h后為乳白色，扁平，不透明，邊緣不整齊，革蘭氏染色呈陰性，桿狀。菌株B003在MRS培養(yǎng)基上，（36±1）℃厭氧培養(yǎng)48 h后，菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)見圖1中的003-1、003-2，菌落呈圓形、白色、凸起，表面光滑、濕潤，邊緣整齊，革蘭氏染色呈陽性，球狀。

圖1 細(xì)菌的菌落及細(xì)胞形態(tài)Fig.1 Colonies and cell morphology of bacteria

2.1.2 細(xì)菌的生理生化鑒定結(jié)果

利用法國梅里埃VITEK微生物鑒定系統(tǒng)及API鑒定系統(tǒng)對菌株B001、B002和B003的生理生化特征進(jìn)行鑒定，并與數(shù)據(jù)庫結(jié)果進(jìn)行比對。其中菌株B001的生理生化鑒定結(jié)果見表2。由表2可知，菌株B001生理生化鑒定試驗結(jié)果為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），鑒定百分率為88%。

表2 菌株B001的生理生化鑒定試驗結(jié)果Table 2 Results of physiological and biochemical identification tests of strain B001

續(xù)表

菌株B002的生理生化鑒定結(jié)果見表3。由表3可知，菌株B002可初步鑒定為銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa），鑒定百分率為97%。

表3 菌株B002的生理生化鑒定試驗結(jié)果Table 3 Results of physiological and biochemical identification tests of strain B002

菌株B003的生理生化鑒定結(jié)果見表4。由表4可知，B003號菌生化鑒定試驗結(jié)果為假腸膜明串珠菌（Leuconostoc pseudomesenteroides），鑒定百分率為83%。

表4 菌株B003的生理生化鑒定試驗結(jié)果Table 4 Results of physiological and biochemical identification tests of strain B003

2.1.3 細(xì)菌分子生物學(xué)鑒定

將菌株B001、B002、B003的16S rRNA基因序列與Gen-Bank內(nèi)已知菌株的相應(yīng)序列進(jìn)行比對，結(jié)果表明，3株菌分別與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）的序列相似度達(dá)99%；與銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的序列相似度達(dá)99%；與假腸膜明串珠菌（Leuconostoc pseudomesenteroides）的序列相似度達(dá)99%。

通過形態(tài)觀察、生理生化試驗并結(jié)合分子生物學(xué)鑒定菌株B001、B002、B003分別為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa）、假腸膜明串珠菌（Leuconostoc pseudomesenteroides）。芽孢桿菌和假腸膜明串珠菌（Leuconostoc pseudomesenteroides）是糖化發(fā)酵曲中的菌，芽孢桿菌屬的細(xì)菌是麥曲中最主要的優(yōu)勢菌，明串珠菌為兼性厭氧菌，是僅次于芽孢桿菌的最主要優(yōu)勢菌，該類菌更適合在低氧壓下生長，這與TERASAKI M等[7，15]的研究結(jié)果一致。本研究從污染黃酒中還分離出銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa），該屬污染菌可從原料、釀造水或環(huán)境中引入，尤其是釀造和生產(chǎn)用水[16]，這種污染菌會對酒的品質(zhì)、風(fēng)味和安全造成影響，需嚴(yán)格控制，謝廣發(fā)等[6]采用分子生物學(xué)手段分析袋裝污染黃酒時，也發(fā)現(xiàn)主要污染菌是假單胞菌屬細(xì)菌。

2.2 真菌的鑒定

2.2.1 真菌的菌落、細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果

從黃酒和污染物中分離、純化得到3株真菌，依次編號為F004、F005和F006。3株真菌在PDA培養(yǎng)基上（28±1）℃需氧培養(yǎng)3～5 d，菌株F004的菌落和細(xì)胞形態(tài)結(jié)果分別見圖2中的4-1、4-2，菌落乳白色、濕潤、質(zhì)地均勻、菌體單細(xì)胞，臘腸形。菌株F005的菌落和細(xì)胞形態(tài)分別見圖2中的5-1、5-2，菌落平坦，橄欖灰色，有輻射紋，菌絲有分支，孢子橢圓形。菌株F006的菌落和細(xì)胞形態(tài)分別見圖2中的6-1、6-2，菌平坦，絲絨狀，落英粉色，閉囊殼球形，子囊孢子圓形，具有典型的紅曲菌形態(tài)特征。

圖2 真菌的菌落及細(xì)胞形態(tài)Fig.2 Colonies and cell morphology of fungi

菌株F004的生化鑒定結(jié)果見表5。由表5可知，菌株F004的生化鑒定試驗結(jié)果為頭狀螺旋地霉（Saprochaetecapitate），鑒定百分率為92%。

表5 菌株F004的生理生化鑒定實驗結(jié)果Table 5 Results of physiological and biochemical identification tests of strain F004

續(xù)表

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

為了進(jìn)一步確定真菌鑒定結(jié)果，將菌株F004的18SrRNA基因序列與GenBank內(nèi)已知菌株頭狀螺旋地霉（Saprochaete capitate）的序列進(jìn)行對比，結(jié)果表明二者相似度達(dá)98%，結(jié)合生理生化反應(yīng)及形態(tài)學(xué)分析，將該菌株鑒定為頭狀螺旋地霉（Saprochaete capitate）。Saprochaetecapitate是本研究首次從黃酒中分離到的污染真菌，之前相關(guān)報道僅在乳制品中分離鑒定出該污染菌[17]。

分別將菌株F005及菌株F006測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行ITS序列同源性比較，選取同源性≥99%的菌株序列，運(yùn)用Mega 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3。由圖3可知，菌株F005為爪哇正青霉（Eupenicillium javanicum）。菌株F006與紫紅曲菌（Monascus purpureus）、紅色紅曲菌（Monascus ruber）及煙色紅曲菌（Monascus fuliginosus）親緣關(guān)系比較接近，結(jié)合形態(tài)學(xué)分析，菌株F006很有可能是紫紅曲菌或紅色紅曲菌。由于黃酒釀造生產(chǎn)中會使用紅曲作為糖化發(fā)酵菌種，本研究將不再對這株菌進(jìn)行更為深入的鑒定分析。

圖3 菌株F005（A）及F006（B）的16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of 16S rDNA sequences of strain F005(A)and strain F006(B)

3 結(jié)論

黃酒釀造后，一段時間的貯存是提升品質(zhì)、協(xié)調(diào)風(fēng)味的必要途徑，但同時黃酒因含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，成了部分微生物的良好培養(yǎng)基而容易被污染。在條件控制不當(dāng)?shù)那闆r下，引入的污染微生物會嚴(yán)重影響黃酒的穩(wěn)定性及品質(zhì)，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失甚至食品安全危害[18]。

本研究利用梯度稀釋法和劃線純化法對壇裝貯存黃酒關(guān)鍵污染微生物進(jìn)行了分離純化，得到編號為B001、B002、B003的3株細(xì)菌和編號為F004、F005、F006的3株真菌。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征觀察、生理生化鑒定和分子生物學(xué)鑒定的方法對分離得到的菌株進(jìn)行鑒定，鑒定菌株B001、B002、B003分別為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa）和假腸膜明串珠菌（Leuconostocpseudomesenteroides），菌株F004、F005分別為頭狀螺旋地霉（Saprochaete capitate）、爪哇正青霉（Eupenicillium javanicum），菌株F006具有紫紅曲菌（Monascus purpureus）、紅色紅曲菌（Monascus ruber）的形態(tài)特征，這為后期對這些菌株的控制提供了理論依據(jù)。

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