国产日韩欧美一区二区三区三州_亚洲少妇熟女av_久久久久亚洲av国产精品_波多野结衣网站一区二区_亚洲欧美色片在线91_国产亚洲精品精品国产优播av_日本一区二区三区波多野结衣 _久久国产av不卡

?

新一代精準(zhǔn)基因編輯工具CRISPR/Cas9的技術(shù)優(yōu)勢(shì)與應(yīng)用局限

2018-06-07 02:30:32吳言郝雅蕎韋璇沈琦柳葉飛王升厚趙洪新
生物技術(shù)通報(bào) 2018年5期
關(guān)鍵詞:核酸酶同源間隔

吳言 郝雅蕎,2 韋璇,2 沈琦 柳葉飛 王升厚 趙洪新

(1. 浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,杭州 310018;2. 沈陽(yáng)師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,沈陽(yáng) 110034;3. 沈陽(yáng)師范大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心,沈陽(yáng) 110034)

近年來(lái),有關(guān)位點(diǎn)特異性核酸酶(Site-specific nuclease,SSN)的基礎(chǔ)理論研究取得了突破性進(jìn)展,使精準(zhǔn)基因編輯技術(shù)在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用,也取得了令人矚目的成就。位點(diǎn)特異性核酸酶在生物體的基因編輯中提供了十分精準(zhǔn)有效的DNA切割方法[1],其中,鋅指核酸酶(Zine finger endonuclease,ZFN)以及類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease,TALENs)已被廣泛應(yīng)用于基因工程技術(shù)中。這兩種核酸酶的切割原理相同,均是將DNA結(jié)合蛋白與核酸內(nèi)切酶FokI融合完成雙鏈特異性切割,但兩種酶DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域較為復(fù)雜,操作上技術(shù)難度相對(duì)大,耗時(shí)長(zhǎng)且容易脫靶[2-4],成為制約其發(fā)展的障礙。2013年,Cathomen[5]基于細(xì)菌的一種獲得性免疫系統(tǒng)改造而成人工核酸內(nèi)切酶 CRISPR Cas 9,在真核和原核生物中進(jìn)行精準(zhǔn)基因編輯嘗試,獲得巨大成功。這種全新的基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)以制作簡(jiǎn)單、成本低、作用高效[5]等優(yōu)勢(shì)迅速發(fā)展,并成功應(yīng)用于各種原核生物和真核生物中,包括大腸桿菌[6]、釀酒酵母[7]、鏈霉菌屬[8]、高等植物[9]、家蠶[10]、果蠅[11]和人類細(xì)胞[12-14]等。本文從 CRISPR/Cas的來(lái)源、結(jié)構(gòu)、作用機(jī)理及影響CRISPR/Cas打靶效率的因素等方面進(jìn)行總結(jié),旨為深刻理解其工作原理和在精準(zhǔn)基因編輯中應(yīng)用提供參考。

1 CRISPR/Cas系統(tǒng)的研究歷史

1987年,日本科學(xué)家在大腸桿菌K12的堿性磷酸酶基因附近發(fā)現(xiàn)串聯(lián)間隔重復(fù)序列[15],但由于其功能無(wú)法確定,并未引起科學(xué)家的注意。1995年,西班牙科學(xué)家Mojica等[16]在地中海極嗜鹽菌(Haloferax mediaterranei)和沃爾卡尼極嗜鹽菌(Haloferax volcanii)中第二次發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)構(gòu)。Mojica敏感地意識(shí)到在親緣關(guān)系如此遠(yuǎn)的微生物中存在如此相似的結(jié)構(gòu),可能有著尚未發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞功能,引起了許多研究人員的極大關(guān)注。2002年,Coffey等和Jansen等[17-18]把串聯(lián)重復(fù)序列正式命名為成簇間隔規(guī)律短回文重復(fù)序列(Clustered regularly short palindromic repeats,CRISPR),但其生物學(xué)功能仍未闡明。2005年,法國(guó)的Bolotin和Vergnaud、西班牙的Mojica三位科學(xué)家領(lǐng)導(dǎo)的3個(gè)實(shí)驗(yàn)室[19-21]幾乎同時(shí)報(bào)道CRISPR中的間隔序列(Spacer)與侵染細(xì)菌的病毒或噬菌體具有很高的同源性,并推測(cè)CRISPR系統(tǒng)可能與細(xì)菌的免疫防御機(jī)制有關(guān)。2007年,Barrangou 等[22]首次發(fā)現(xiàn)嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)能夠通過(guò)CRISPR/Cas系統(tǒng)抵抗噬菌體的入侵,證實(shí)了CRISPR/Cas可以獲得性的提供細(xì)菌對(duì)抗噬菌體的能力。2012年,Sternberg等[23]發(fā)現(xiàn)了II型CRISPR系統(tǒng),該系統(tǒng)中只需要一個(gè)160 kD的Cas9蛋白,同時(shí)利用RNA就可以完成識(shí)別和切割靶向DNA序列。這一防御系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)激發(fā)了科研工作者對(duì)于其在基因編輯作用中的研究熱情,利用和優(yōu)化CRISPR系統(tǒng)對(duì)基因進(jìn)行精準(zhǔn)編輯的探索研究越來(lái)越多,科研成果也層出不窮,精準(zhǔn)編輯功能在細(xì)菌、真菌和哺乳動(dòng)物中都得到了認(rèn)證,是新一代基因編輯技術(shù)。

2 CRISPR/Cas系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)

隨著生物信息學(xué)的發(fā)展及對(duì)越來(lái)越多微生物基因組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析,人們發(fā)現(xiàn)在已知物種中有90%的古細(xì)菌和40%的細(xì)菌的基因組中含有CRISPR位點(diǎn),而且絕大多數(shù)的細(xì)菌和古細(xì)菌中至少含有一個(gè)CRISPR基因座,極少數(shù)的古細(xì)菌中含有上百個(gè)CRISPR基因座,說(shuō)明了CRISPR/Cas系統(tǒng)對(duì)于細(xì)菌免疫防御機(jī)制是十分重要的[24]。CRISPR/Cas基因座由3個(gè)部分組成,5'端為tracrRNA基因,中間是Cas家族蛋白,3'端為CRISPR基因座,主要由一個(gè)前導(dǎo)序列、23-50 bp的重復(fù)序列和間隔序列串聯(lián)組成,間隔序列由17-84 bp組成,平均長(zhǎng)度約為36 bp。

Cas蛋白來(lái)自于細(xì)菌具有切割DNA的活性蛋白,除了探究已知的細(xì)菌Cas蛋白差異之外,環(huán)境中存在著很多不為人知或不可培養(yǎng)的微生物種類,研究人員從土壤,地下水,酸性礦泉水等富含微生物的環(huán)境中取材,將這些微生物的宏基因組信息與CRISPR和Cas1序列進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)了兩類新型的CRISPR-Cas系統(tǒng),將其命名為CRISPR-CasX和CRISPR-CasY,其中CasX蛋白約有980個(gè)氨基酸,CasX蛋白約有1 200個(gè)氨基酸[25]??梢?jiàn)CRISPRCas系統(tǒng)在微生物領(lǐng)域存在的普遍性,具有巨大的基因編輯潛能。

CRISPR-Cas系統(tǒng)中Cas基因進(jìn)化速度最快,根據(jù)單亞基和多亞基的crRNA效應(yīng)復(fù)合物定義可以將CRISPR-Cas系統(tǒng)分為兩大類:ClassI和ClassII。ClassI包 括 3個(gè) 亞 型 :TypeI、TypeIII和 TypeIV,ClassII包括兩個(gè)亞型:TypeII和 TypeV[26]。研究表明,ClassII效應(yīng)蛋白Cpf1是一類新型的CRISPR-Cas DNA核酸內(nèi)切酶,Cpf1只包含RuvC結(jié)合結(jié)構(gòu)域但不包含HNH結(jié)合結(jié)構(gòu)域[27]。Cpf1可以介導(dǎo)基因組編輯的翻譯后調(diào)節(jié),Cas9和Cpf1的gRNA序列有明顯差異,研究人員設(shè)計(jì)同時(shí)帶有Cpf1的5'-支架序列和Cas9的3'-端序列融合版的引導(dǎo)RNA(fgRNA),fgRNA能夠通用于Cpf1和Cas9兩種類型的核酸酶[28]。Zhang等[29]發(fā)現(xiàn)具有基因編輯潛力的 C2c2位于Leptotrichia shahii中ClassII系統(tǒng)的TypeVI上。研究表明C2c2能夠調(diào)控RNA指導(dǎo)的單鏈RNA的斷裂,深度測(cè)序發(fā)現(xiàn)了C2c2是RNA指導(dǎo)的ssRNA發(fā)生斷裂效應(yīng)物。Zhang等[30]證明了來(lái)自化膿鏈球菌的Cas9酶(SpCas9)和來(lái)自金黃色葡萄球菌的Cas9核酸酶(SaCas9)具有相當(dāng)?shù)腄NA靶向精確度。這些高效Cas9蛋白的發(fā)現(xiàn),對(duì)靶向基因表達(dá)調(diào)控提供了更加高效的基因編輯方法。

3 II型CRISPR/Cas系統(tǒng)的作用機(jī)理

II型CRISPR/Cas系統(tǒng)行使功能主要分為3個(gè)階段(圖1):即新間隔序列的獲取、CRISPR位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄與加工、CRISPR/Cas系統(tǒng)對(duì)外源DNA的降解。

第一階段新間隔序列(Spacer)的獲取可分為3個(gè)過(guò)程,當(dāng)噬菌體首次侵染攜有CRISPR系統(tǒng)的細(xì)菌中時(shí),宿主首先掃描并識(shí)別入侵核酸的PAM序列,將臨近PAM序列的外源DNA作為候選的原間隔序列(Protospacer)。一般來(lái)說(shuō),臨近間隔序列的幾個(gè)堿基比較保守,被稱為(Protospacer adjacent motifs,PAM)序列,通常為NGG[31];接著在Cas1和Cas2等蛋白質(zhì)的作用下,將入侵DNA切割成長(zhǎng)度約為48 bp的核酸片段,最后通過(guò)相關(guān)蛋白質(zhì)的作用,將其中一個(gè)核酸片段整合到前導(dǎo)序列和第一個(gè)重復(fù)序列之間,形成新的間隔序列,與這個(gè)序列同源的病毒DNA稱為原間隔序列。

第二階段,當(dāng)相同的外源DNA再次侵入時(shí),CRISPR基因座首先轉(zhuǎn)錄成長(zhǎng)的前體CRISPR RNA(pre-crRNA),然后在RNaseⅢ的參與下被切割為長(zhǎng)度不等的核酸小片段,即包含一段間隔序列和部分重復(fù)序列的成熟crRNA[32]。crRNA與反轉(zhuǎn)錄激活RNA(tracrRNA)通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與Cas9蛋白形成靶向復(fù)合物crRNP,其在降解外源DNA的階段起到重要作用[13,33-34]。

第三階段是對(duì)外源DNA的干擾。復(fù)合體crRNP通過(guò)間隔序列尋找到與外源DNA互補(bǔ)的靶序列,此時(shí)Cas9起到切割雙鏈DNA的作用。在II型CRISPR系統(tǒng)中,Cas9蛋白的HNH與RuvC核酸酶結(jié)構(gòu)域能夠分別切割間隔序列的互補(bǔ)鏈與非互補(bǔ)鏈,導(dǎo)致雙鏈DNA斷裂(Double strand breaks,DSBs)被降解,從而抵御了外源DNA的入侵[35]。

圖1 II型CRISPR-Cas9系統(tǒng)抵御外源噬菌體的獲得性免疫機(jī)制

4 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)

近年來(lái),有關(guān)利用CRISPR/Cas9進(jìn)行精準(zhǔn)基因編輯的應(yīng)用研究發(fā)展十分迅速,已在微生物、植物、動(dòng)物及癌癥基因治療等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用,與以前的基因編輯方法相比,展現(xiàn)出巨大應(yīng)用潛力和應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。

4.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在生物育種中的應(yīng)用

在微生物學(xué)研究領(lǐng)域,應(yīng)用該技術(shù)在粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)[36]中將clr-2啟動(dòng)子替換為β微管蛋白啟動(dòng)子增強(qiáng)了纖維素酶的表達(dá);Fuller等[37]在煙曲霉菌(Aspergillus fumigatus)中高效靶標(biāo)酮化合物合酶基因,并進(jìn)一步驗(yàn)證了組成型表達(dá)的Cas9核酸酶本身對(duì)煙曲霉生長(zhǎng)和毒力沒(méi)有危害作用;Wu等[38]成功利用CRISPR/Cas9技術(shù)在產(chǎn)氣腸桿菌中敲除NADH脫氫酶基因簇nuoC/D和nuoC/D/E基因,得到了雙敲除和三敲除菌株,在搖瓶水平和發(fā)酵罐水平表征菌株,結(jié)果表明在厭氧發(fā)酵罐中氫氣的產(chǎn)量是原始菌株的1.95倍,產(chǎn)氫量得到了很大的提高,為生物制氫提供了新的思路。

在植物學(xué)研究領(lǐng)域,F(xiàn)eng等[39]將玉米的標(biāo)記基因Zmzb7進(jìn)行改造優(yōu)化產(chǎn)量,結(jié)果顯示CRISPR/Cas9系統(tǒng)在玉米的常染色質(zhì)和異染色質(zhì)區(qū)域都可以進(jìn)行高效的基因編輯;Zhang等[40]通過(guò)CRISPR/Cas9瞬時(shí)表達(dá)獲得了初代非轉(zhuǎn)基因純合子小麥突變株;Tian等[41]成功敲除了西瓜中的八氫番茄紅素脫氫酶,結(jié)果顯示CRISPR/Cas9系統(tǒng)在西瓜中的基因編輯效率達(dá)到100%。這些研究表明CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)為植物種子改良提供了新路徑。

在動(dòng)物學(xué)研究領(lǐng)域,利用CRISPR/Cas9技術(shù)已經(jīng)成功對(duì)綿羊[42]、兔子[43]等中小型哺乳類動(dòng)物進(jìn)行了基因編輯,這些研究成果為以中小型動(dòng)物模型,探究人類疾病的發(fā)病機(jī)制提供參考。為了獲得患有蕾特氏癥的動(dòng)物模型,科學(xué)家將恒河猴(Macaca mulatta)和食蟹猴(Macaca fascicularis)的MESP2基因成功敲除,為人類研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了實(shí)驗(yàn)?zāi)P停?4]。

4.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在基因治療中的應(yīng)用

基因治療是治療病毒性疾病的熱點(diǎn),許多癌癥都是由病毒引起,如肝癌由乙肝病毒引起,宮頸癌由人乳頭瘤病毒引起,艾滋病因感染HIV-1病毒引起等。CRISPR/Cas9來(lái)源于細(xì)菌自身的防御系統(tǒng)[45],用該系統(tǒng)抵御并清除外來(lái)病毒感染抑制病毒生長(zhǎng)甚至可治愈病癥。Khalili等[46]發(fā)現(xiàn)Cas9/LTR-gRNA在細(xì)胞中表達(dá)時(shí)能夠在HIV-1病毒整合前明顯阻止其感染細(xì)胞。該項(xiàng)技術(shù)對(duì)于治愈病毒感染的疾病有著重要的指導(dǎo)意義。Maddalo等[47]運(yùn)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在小鼠體內(nèi)敲除了EML4-ALK融合基因,對(duì)于晚期非小細(xì)胞肺癌臨床治療提供了新的方向。Xie等[48]敲除了血紅蛋白β(HBB)基因?qū)θ祟惁?地中海貧血癥的發(fā)生機(jī)制進(jìn)行了探究。值得一提的是,Rong等[49]證明Cas9切口酶可以精確靶標(biāo)人體胚胎干細(xì)胞中的長(zhǎng)鏈DNA模板,其編輯效率大約在5%。這預(yù)示著該技術(shù)在不久的將來(lái)會(huì)對(duì)優(yōu)化人類受精卵起到深遠(yuǎn)的影響。

表1例舉了部分已成功利用CRISPR/Cas9進(jìn)行基因編輯的實(shí)例。從這些例子及研究者的文獻(xiàn)研究報(bào)告中可以看出,CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)不僅設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、使用范圍廣,而且操作步驟簡(jiǎn)潔、實(shí)驗(yàn)周期短、驗(yàn)證過(guò)程容易,具有十分廣闊的應(yīng)用前景。作為新一代的基因編輯工具,在解析基因功能,基因新性功能的探索,疾病的基因治療,生物基因改造等方面是強(qiáng)有力的方法,是探索生命的奧秘強(qiáng)有力的分子工具。

表1 部分已經(jīng)報(bào)道成功利用CRISPR/Cas9實(shí)現(xiàn)基因組編輯的實(shí)例

5 CRISPR/Cas9編輯技術(shù)的應(yīng)用局限

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是一種方便快捷的基因改造方法,其通過(guò)sgRNA中的N20序列尋找并識(shí)別靶位點(diǎn),如果需要進(jìn)行多位點(diǎn)修飾,可以設(shè)計(jì)多條sgRNA[51-53]。但是最新的研究表明sgRNA的錯(cuò)配為5個(gè)堿基時(shí),切割仍能夠發(fā)生,這就導(dǎo)致了CRISPR/Cas9系統(tǒng)存在較高的脫靶效應(yīng)[54-55]。為了降低CRISPR/Cas9的脫靶效應(yīng),研究人員對(duì)影響CRISPR/Cas9打靶效率的因素進(jìn)行了深入研究并提出了一系列解決方法。

5.1 影響CRISPR/Cas9系統(tǒng)脫靶效應(yīng)的因素及解決方法

sgRNA結(jié)構(gòu)和組成能夠引起脫靶效應(yīng)[56]。研究表明增加[57]或減少[58]2-3個(gè)核苷酸的sgRNA能夠減少錯(cuò)配率從而增加靶序列的專一性。John等[59]創(chuàng)造了新的sgRNA設(shè)計(jì)規(guī)則并建立了人體和小鼠的全基因庫(kù),用基因庫(kù)設(shè)計(jì)出的sgRNA能夠有效減少CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶效率。

Cas9蛋白的結(jié)構(gòu)對(duì)打靶效率也有著重要的影響。野生型Cas9蛋白具有切割雙鏈DNA,的活性,形成雙鏈斷裂(Double-strand Breaks,DSBs)從而增加脫靶效應(yīng)的幾率。Frock等[60]將Cas9蛋白改造為Cas9 nickase(nCas9),nCas9能夠使Cas9蛋白的HNH或RuvC核酸酶結(jié)構(gòu)域失活而形成單鏈斷裂(Single-strand Breaks,SSBs),單鏈缺口會(huì)通過(guò)高保真的堿基切除修復(fù)方式進(jìn)行修復(fù)以減少脫靶效應(yīng);Qi等[61]把 Cas9 蛋白改造為 Dead Cas9(dCas9)(圖2-A),dCas9能夠使HNH和RuvC兩個(gè)活性位點(diǎn)均失活,將dCas9與sgRNA在細(xì)胞中共表達(dá),sgRNA介導(dǎo)dCas9與DNA結(jié)合可以抑制基因的起始轉(zhuǎn)錄從而減少脫靶效應(yīng)??茖W(xué)家還發(fā)現(xiàn)將 dCas9 與 FokI核酸酶結(jié)合形成融合蛋白(FokI-dCas9)(圖2-B),可以增加CRISPR/Cas9的靶專一性,通過(guò)一對(duì)sgRNA和dCas9s識(shí)別靶序列,此時(shí)FokI二聚體切割DNA,這種方法雖然能降低脫靶效應(yīng),但同時(shí)也會(huì)降低其打靶活力,并且對(duì)于FokI二聚體來(lái)說(shuō)N20的長(zhǎng)度對(duì)其活力有著十分重要的影響,因此限制了基因組中潛在的靶序列數(shù)量[62-63]。Slaymaker等[64]采用有針對(duì)性的深測(cè)序和無(wú)偏全基因組脫靶效應(yīng)分析評(píng)估Cas9的切割效率,證明了增強(qiáng)型化膿鏈球桿菌Cas9突變體(eSpCas9)能夠減弱脫靶效應(yīng)并且更加精確地進(jìn)行切割。

此外,PAM序列的長(zhǎng)度也是解決脫靶效應(yīng)的策略之一。金黃色釀膿葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Cas9蛋 白(SaCas9) 識(shí) 別 的 PAM 區(qū) 為的 NNGRRT(NNGAAT、NNGAGT、NNGGAT和NNGGGT),嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)Cas9蛋 白(StCas9) 的PAM序 列 為NGGNG和NNAGAAW,腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis)Cas9蛋白(NmCas9)的PAM序列為NNNNGATT,實(shí)驗(yàn)表明這些較長(zhǎng)的PAM序列能夠有效地減少脫靶效應(yīng)[65-67]。這表明更長(zhǎng)的PAM序列在全基因組中,特異性更高,潛在的脫靶位點(diǎn)少,為進(jìn)一步增強(qiáng)靶序列的專一性創(chuàng)造了條件。

圖2 CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因編輯機(jī)制

5.2 同源重組率對(duì)CRISPR/Cas9打靶效應(yīng)的影響

當(dāng)Cas9蛋白切割雙鏈DNA形成雙鏈斷裂后,細(xì)胞會(huì)采取非同源末端連接機(jī)制(Nonhomologous end joining,NHEJ) 或 同 源 重 組(Homologous recombination,HR)修復(fù)受損的細(xì)胞,但是非同源末端連接修復(fù)機(jī)制會(huì)引發(fā)由堿基的插入或刪除從而導(dǎo)致基因突變,同源重組修復(fù)機(jī)制能夠精確的對(duì)細(xì)胞進(jìn)行修復(fù),增強(qiáng)CRISPR/Cas9系統(tǒng)的特異性。在真核生物中研究人員發(fā)現(xiàn)KU70、KU80和DNA連接酶IV是NHEJ通路中的關(guān)鍵因子。德國(guó)MDC研究所的研究人員使用DNA連接酶IV抑制劑SCR7進(jìn)行了基因沉默,并表達(dá)了腺病毒蛋白E1B55K和E4orf6,抑制KU70和DNA連接酶IV能夠?qū)⑼炊ㄏ蛐迯?fù)(Homology directed repair,HDR)效率提高4-5倍。在人類和小鼠細(xì)胞系中腺病毒蛋白與Cas9系統(tǒng)共表達(dá)時(shí),HDR效率提高了8倍,大幅度抑制了NHEJ活性[68]。Whitehead研究所的研究人員在對(duì)受精卵進(jìn)行基因編輯時(shí)添加了SCR7抑制劑,這項(xiàng)研究將CRISPR/Cas的HDR率提高了19倍[69]。另一方面,研究人員還發(fā)現(xiàn)供體DNA的長(zhǎng)度也會(huì)影響同源重組率。Lin等[70]發(fā)現(xiàn)至少需要15 nt的同源臂長(zhǎng)度才能實(shí)現(xiàn)同源重組。而Rong等[71]比較了引入長(zhǎng)度為1 kb的上下游同源臂與引入單側(cè)同源臂在人類胚胎干細(xì)胞中的同源重組效率,實(shí)驗(yàn)表明引入標(biāo)靶基因的雙側(cè)通同源臂后的HDR效率更高。

6 CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用前景

特別是近年來(lái)研究人員利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行精準(zhǔn)基因編輯,也取得了令人矚目的研究成果,無(wú)數(shù)成功的例子和高水平文章的發(fā)表顯示了其強(qiáng)大應(yīng)用潛力。盡管CRISPR/Cas9系統(tǒng)仍存著如打靶效率低、靶專一性不強(qiáng)等技術(shù)局限,但仍說(shuō)明CRISPR/Cas9系統(tǒng)仍需完善,有巨大的研究空間需要探索。許多研究人員從CRISPR/Cas9系統(tǒng)組成結(jié)構(gòu)分析和攻關(guān)嘗試,改良sgRNA的結(jié)構(gòu),增強(qiáng)靶特異性是最直接的手段;也有研究人員致力于探索Cas9的結(jié)構(gòu)及功能,篩選和改造特異性更強(qiáng)的Cas蛋白,來(lái)解決脫靶效應(yīng)問(wèn)題,同時(shí)尋找提高同源重組率的方法對(duì)提高打靶效率也有一定的作用。相信通過(guò)研究人員的努力和嘗試,及隨著生物技術(shù)的發(fā)展,CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用中存在的技術(shù)局限,終將被攻克,CRISPR/Cas新一代基因編輯系統(tǒng)在農(nóng)業(yè),醫(yī)學(xué)及生物等各個(gè)領(lǐng)域?qū)⒕哂懈鼜V闊的應(yīng)用前景,發(fā)揮更重要的作用。

[1]Gaj T, Gersbach CA, Barbas CF. ZFN, TALEN, and CRISPR/Casbased methods for genome engineering[J]. Trends Biotechnol,2013, 31:397-405.

[2]Capecchi MR. Gene targeting in mice:functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century[J]. Nat Rev Genet, 2005, 6(6):507-512.

[3]Carroll D. Genome engineering with targetable nucleases[J].Annu Rev Biochem, 2014, 83:409-439.

[4]Yu YJ, Bradley A. Engineering chromosomal rearrangements in mice[J]. Nat Rev Genet, 2001, 2(10):780-790.

[5]Mussolino C, Cathomen T. RNA guides genome engineering[J].Nat Biotechnol, 2013, 31(3):208-209.

[6]Jiang W, Bikard D, Cox D, et al. Marraffini LA. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems[J]. Nat Biotechnol, 2013, 31:233-239.

[7]DiCarlo JE, Norville JE, Mali P, et al. Church GM. Genome engineering inSaccharomyces cerevisiaeusing CRISPR-Cas systems[J]. Nucleic Acids Res, 2013, 41:4336-4343.

[8]Cobb RE, Wang Y, Zhao H. High-efficiency multiplex genome editing ofStreptomycesspecies using an engineered CRISPR/Cas system[J]. ACS Synthetic Biology, 2014, 4(6):723-728.

[9]Shan Q, Wang Y, Li J, et al. Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system[J]. Nat Biotechnol, 2013,31:686-688.

[10]Wang Y, Li Z, Xu J, et al. The CRISPR/Cas System mediates efficient genome engineering inBombyxmori[J]. Cell Res,2013, 23:1414-1416.

[11]Yu Z, Ren M, Wang Z, et al. Highly efficient genome modifications mediated by CRISPR/Cas9 inDrosophila[J]. Genetics, 2013,195:289-291.

[12]Cong L, Ran FA, Cox D, et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems[J]. Science, 2013, 339:819-823.

[13]Mali P, Yang L, Esvelt KM, et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9[J]. Science, 2013, 339:823-826.

[14]Zhang Q, Rho M, Tang H, et al. CRISPR-Cas systems target a diverse collection of invasive mobile genetic elements in human microbiomes[J]. Genome Biology, 2013, 14(4):1-15.

[15]Ishino Y, Shinagawa H, Makino K, et al. Nucleotide sequence of the lap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion inEscherichia coli, and identification of the gene product[J]. J Bacteriol, 1987, 169(12):5249-5433.

[16]Mojica FJ, Ferrer C, Juez G, et al. Long stretches of short tandem repeats are present in the largest replicons of theArchaea Haloferax mediterraneiandHaloferax volcaniiand could be involved in replicon partitioning[J]. Mol Microbiol, 1995, 17(1):85-93.

[17]Coffey A, Ross RP. Bacteriophage-resistance systems in dairy starter strains, molecular analysis to application[J]. Anton Leeuw, 2002, 82(1):303-321.

[18]Jansen R, Embden JDAV, Gaastra W, et al. Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes[J]. Mol Microbiol, 2002, 43(6):1565-1575.

[19]Bolotin A, Quinquis B, et al. Clustered regularly interspaced short palindrome repeats(CRISPRs)have spacers of extrachromosomal origin[J]. Microbiology, 2005, 151:2551-2561.

[20]Pourcel C, Salvignol G, Vergnaud G. CRISPR elements inYersinia pestisacquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies[J].Microbiology, 2005, 151:654-663.

[21]Mojica FJ, Díez-Villase?or C, García-Martinez J, et al. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements[J]. Journal of Molecular Evolution,2005, 60(2):174-182.

[22]Barrangou, R, Fremaux C, Deveau H, et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes[J]. Science,2007, 315:1709-1712.

[23]Sternberg SH, Haurwitz RE, Doudna JA. Mechanism of substrate selection by a highly specific CRISPR endoribonuclease[J].RNA, 2012, 18(4):661-672.

[24]Burstein D, Harrington LB, et al. New CRISPR-Cas syst-ems from uncultivated microbes[J]. Nature, 2017, 542(7640):237-241.

[25]Grissa I, Vergnauud G, Pourcel C. The CRISPRdb database and tools to display CRISPRs and to generate dictionaries of spacers and repeats[J]. BMC Bioinformatics, 2007, 8 :172.

[26]Sergey S, Abudayyeh OO, Makarova KS, et al. Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR-Cas Systems[J]. Molecular Cell, 2015, 60(3):385.

[27]Schunder E, Rydzewski K, Grunow R, et al. First indication for a functional CRISPR/Cas system inFrancisella tularensis[J]. Int J Med Microbiol, 2013, 303(2):51-60.

[28]Kweon J, Jang AH, Kim DE, et al. Fusion guide RNAs for orthogonal gene manipulation with Cas9 and Cpf1[J]. Nat Commun, 2017, 8(1):1723.

[29]Abudayyeh OO, Gootenberg JS, Konermann S, et al. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector[J]. Science, 2016, 353(6299):aaf5573.

[30]Ran FA, Cong L, et al.In vivogenome editing usingStaphylococcus aureusCas9[J]. Nature, 2015, 520(7546):186.

[31]Gasiunas G, Barrangou R, Horvath P, et al. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2012, 109(39):E2579-2586.

[32]Pougach K, Semenova E, Bogdanova E, et al. Transcription,processing and function of CRISPR cassettes inEscherichia coli[J]. Mol Microbiol, 2010, 77(6):1367-1379.

[33]Sander JD, Joung JK. CRISPR-Cas systems for editing regulating and targeting genomes[J]. Nat Biotechnol, 2014, 32(4):347-355.

[34]Nishimasu H, Ran FA, Hsu PD, et al. Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA[J]. Cell, 2014, 156(5):935-949.

[35]Jinek M, Chylisnki K, Fonfara I, et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity[J].Science, 2012, 337(6096):816-821.

[36]Matsu-ura T, Baek M, Kwon J, et al. Efficient gene editing inNeurospora crassawith CRISPR technology[J]. Fungal Biology and Biotechnology, 2015, 2(1):1-7.

[37]Fuller KK, Chen S, Loros JJ, et al. Development of the CRISPR/Cas9 system for targeted gene disruption inAspergillus fumigatus[J]. Eukaryotic Cell, 2015, 14(11):1073-1080.

[38]Wu Y, Hao Y, Wei X, et al. Impairment of NADH dehydrogenase and regulation of anaerobic metabolism by the small RNA RyhB and NadE for improved biohydrogen production inEnterobacter aerogenes[J]. Biotechnology for Biofuels, 2017, 10(1):248.

[39]Feng C, Yuan J, Wang R, et al. Efficient targeted genome modification in maize using CRISPR/Cas9 system[J]. Journal of Genetics and Genomics, 2016, 43(1):37-43.

[40]Zhang Y, Liang Z, Zong Y, et al. Efficient and transgene-free genome editing in wheat through transient expression of CRISPR/Cas9 DNA or RNA[J]. Nat Commun, 2016, 7:12617.

[41]Tian S, Jiang L, Gao Q, et al. Efficient CRISPR/Cas9-based gene knockout in watermelon[J]. Plant Cell Reports, 2016, 36:1-8.

[42]Wu M, Wei C, Lian Z, et al. Rosa26-targeted sheep gene knock-in via CRISPR-Cas9 system[J]. Sci Rep, 2016, 6:24360.

[43]Lv Q, Yuan L, Deng J, et al. Efficient generation of myostatin gene mutated rabbit by CRISPR/Cas9[J]. Sci Rep, 2016, 6:25029.

[44]Liu H, et al. TALEN-mediated gene mutagenesis in rhesus and cynomolgus monkeys[J]. Cell Stem Cell, 2014, 14(3):323-328.

[45]Lu XJ, Xue HY, Ke ZP, et al. CRISPR-Cas9:a new and promising player in gene therapy[J]. Journal of Medical Genetics, 2015, 52(5):289-296.

[46]Khalili K, Kaminski R, Gordon J, et al. Genome editing strategies:potential tools for eradicating HIV-1/AIDS[J]. Journal of Neurovirology, 2015, 21(3):310-321.

[47]Maddalo D, Manchado E, Concepcion CP, et al.In vivoengineering of oncogenic chromosomal rearrangements with the CRISPR/Cas9 system[J]. Nature, 2015, 524(7566):502.

[48]Xie F, Ye L, Chang JC, et al. Seamless gene correction of β-thalassemia mutations in patient-specific iPSCs using CRISPR/Cas9 and piggyBac[J]. Genome Res, 2014, 24(9):1526.

[49]Rong Z, Zhu S, Yang X, et al. Homologous recombination in human embryonic stem cells using CRISPR/Cas9 nickase and a long DNA donor template[J]. Protein & Cell, 2014, 5(4):258.

[50]Kang Y, Zheng B, Shen B, et al. CRISPR/Cas9-mediated Dax1 knockout in the monkey recapitulates human AHC-HH[J].Human Molecular Genetics, 2015, 24(25):7255-7264.

[51]Qi L, Larson M, Gilbert L, et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression[J]. Cell, 2013, 152:1173-1183.

[52]Cho SW, Kim S, Kim JM, et al. Targeted genome enginerring in human cells with the Cas9 RNA-guide guided endounuclease[J].Nat Biotechnol, 2013, 31:230-232.

[53]Wang H, Yang H, Shivalila C, et al. One-step generation of mice carting mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering[J]. Cell, 2013, 153:910-918.

[54]Hsu PD, Scott DA, et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases[J]. Nat Biotechnol, 2013, 31:827-832.

[55]Pattanayak V, Lin S, Guilinger JP, et al. High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity[J]. Nat Biotechnol, 2013, 31:839-843.

[56]Cho SW, Kim S, Kim Y, et al. Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases[J]. Genome Res, 2014, 24:132-141.

[57]Kim D, Bae S, Park J, et al. Digenome-seq:genome-wide profiling of CRISPR-Cas9 off-target effects in human cells[J]. Nature Methods, 2015, 12(3):237-243.

[58]Fu Y, Sander JD, Reyon D, et al. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs[J]. Nat Biotechnol,2014, 32:279-284.

[59]John GD, Nicolo F, Meagan S, et al. Optimized sgRNA design to maximize activity minimize off-target effects of CRISPRCas9[J]. Nat Biotechnol, 2016, 34:184-191.

[60]Frock RL, Hu J, Meyers R M, et al. Genome-wide detection of DNA double-stranded breaks induced by engineered nucleases[J].Nat Biotechnol, 2015, 33:179-186.

[61]Qi L, Larson M, Gilbert L, et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression[J]. Cell, 2013, 152(5):1173-1183.

[62]Guilinger JP, Thompson DB, Liu DR. Fusion of catalytically inactive Cas9 to FokI nuclease improves the specificity of genome modification[J]. Nat Biotechnol, 2014, 32(6):287-305.

[63]Aouida M, Eid A, Ali Z, et al. Efficient fdCas9 synthetic endonuclease with improved specificity for precise genome engineering[J]. PLoS One, 2015, 10(7):e0133373.

[64]Slaymaker IM, Gao L, Zetsche B, et al. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity[J]. Science, 2016, 351 :84-88.

[65]Ran FA, Cong L, Yan WX, et al.In vivogenome editing usingStaphylococcus aureusCas9[J]. Nature, 2015, 520(7546):202-204.

[66]Müller M, Lee CM, Gasiunas G, et al.Streptococcus thermophilusCRISPR-Cas9 systems enable specific editing of the human genome[J]. Molecular Therapy, 2016, 24(3):636-644.

[67]Lee CM, Cradick TJ, Gang B. The Neisseria meningitides CRISPR/Cas9 system enables specific genome editing in mammalian cells[J]. Molecular Therapy, 2016, 24(3):645-654.

[68]Chu VT, Weber T, et al. Increasing the efficiency of homologydirected repair for CRISPR-Cas9-induced precise gene editing in mammalian cells[J]. Nat Biotechnol, 2015, 33(5):543-548.

[69]Maruyama T, Dougan SK, Truttmann MC, et al. Increasing the efficiency of precise genome editing with CRISPR-Cas9 by inhibition of nonhomologous end joining[J]. Nat Biotechnol,2015, 33(5):538-542.

[70]Lin S, Staahl B, Alla RK, et al. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery[J]. Elife Science, 2014, 3(6):e04766-e04766.

[71]Rong Z, Zhu S, Yang X, et al. Homologous recombination in human embryonic stem cells using CRISPR/Cas9 nickase and a long DNA donor template[J]. Protein & Cell, 2014, 5(4):258.

猜你喜歡
核酸酶同源間隔
藥食同源
——紫 蘇
粘質(zhì)沙雷氏菌全能核酸酶的研究進(jìn)展
兩岸年味連根同源
以同源詞看《詩(shī)經(jīng)》的訓(xùn)釋三則
間隔問(wèn)題
含季銨鹽的芳酰腙配體的銅 (Ⅱ)配合物的合成和表征:體外DNA鍵合和核酸酶活性
多種Cas12a蛋白變體能識(shí)別不同的PAM序列(2020.4.27 Plant Biotechnology Journal)
間隔之謎
用megaTAL 核酸酶對(duì)原代人T 細(xì)胞CCR5 基因座進(jìn)行有效修飾可建立HIV-1 抵抗力
虔誠(chéng)書畫乃同源
益阳市| 辛集市| 永和县| 邢台县| 太白县| 宜丰县| 西乡县| 普陀区| 宜城市| 大关县| 喀喇| 体育| 扎鲁特旗| 涪陵区| 南涧| 襄垣县| 木兰县| 竹溪县| 阳谷县| 依安县| 花莲县| 云龙县| 新蔡县| 宝山区| 手游| 冕宁县| 嵊州市| 千阳县| 天长市| 大理市| 土默特右旗| 乡城县| 桦南县| 泌阳县| 镇坪县| 康保县| 本溪市| 社旗县| 鹿邑县| 宁海县| 平泉县|