王躍強(qiáng) Avinash Bhandoola

（1. Laboratory of Genome Integrity，Center for Cancer Research，National Cancer Institute，Bethesda，MD 20892-4254，USA ；2. 深圳國(guó)家基因庫(kù)合成與編輯平臺(tái)，深圳 518083）

小鼠免疫系統(tǒng)涉及種類眾多、功能特性各異的多種類型細(xì)胞，揭示這些免疫細(xì)胞分化發(fā)育的機(jī)制是免疫學(xué)研究的核心工作之一。在小鼠中，造血干細(xì)胞（Hematopoietic stem cells，HSC）是其他血細(xì)胞的始祖，HSC通過(guò)分化發(fā)育可以建立整個(gè)血細(xì)胞系統(tǒng)（圖1-A）［1-2］。近年來(lái)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)快速發(fā)展，為免疫學(xué)研究提供了新方法。如能對(duì)分離的小鼠造血干細(xì)胞實(shí)施基因編輯，再通過(guò)體內(nèi)移植或體外誘導(dǎo)促使其分化發(fā)育；通過(guò)細(xì)胞表面抗原分析或單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析，能快捷地研究各類免疫細(xì)胞分化發(fā)育的分子機(jī)制。為此，需要建立針對(duì)造血干細(xì)胞和其他分化度較低的前體免疫細(xì)胞的基因編輯技術(shù)方法。

目前，針對(duì)人類CD34+造血干細(xì)胞（CD34+Hematopoietic stem/progenitor cell，CD34+HSPC） 實(shí)施基因編輯的報(bào)道已有多項(xiàng)，但針對(duì)小鼠造血干細(xì)胞實(shí)施基因編輯的研究鮮有報(bào)道。人類對(duì)CD34+HSPC的研究通常采用磁珠法，即從臍帶血或外周血中分離造血干細(xì)胞，使用電轉(zhuǎn)或病毒載體（如慢病毒載體或腺相關(guān)病毒載體）實(shí)施遺傳轉(zhuǎn)化，通過(guò)基因編輯實(shí)現(xiàn)基因治療等多種目的［3-10］。在小鼠造血干細(xì)胞中實(shí)施基因編輯僅有少量報(bào)道。2014年，Heckl等［11］從小鼠骨髓中分離LSK細(xì)胞，并使用慢病毒載體實(shí)施基因編輯敲除了Smc3、Ezh2等基因；隨后將LSK細(xì)胞移植到受體小鼠體內(nèi)，在長(zhǎng)期培養(yǎng)后構(gòu)建了小鼠急性髓系白血病模型。2016年，Gundry等［4］從小鼠骨髓中分離到Kit+骨髓細(xì)胞，并通過(guò)電轉(zhuǎn)實(shí)施了基因編輯。此外，有多項(xiàng)報(bào)道介紹了針對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等分化度高的免疫細(xì)胞實(shí)施基因編輯的研究成果［12-13］。相關(guān)工作極大的拓展了CRISPR/Cas技術(shù)在免疫學(xué)研究中的應(yīng)用。本研究從Cas9敲入小鼠骨髓中分離得到LSK細(xì)胞，并從其胸腺中分離得到DN細(xì)胞。LSK細(xì)胞和DN細(xì)胞都是包含多種細(xì)胞類型的混合細(xì)胞。LSK細(xì)胞包含造血干細(xì)胞HSC和輕度分化的MPP細(xì)胞等，其細(xì)胞表面分子特征為L(zhǎng)in-、Sca1+、Kit+。DN細(xì)胞包含ETP（DN1）細(xì)胞、DN2細(xì)胞、DN3細(xì)胞和DN4細(xì)胞。針對(duì)LSK細(xì)胞和DN細(xì)胞，用小鼠干細(xì)胞病毒（Mouse stem cell virus，MSCV）作為載體對(duì)Tcf7（其編碼的蛋白為T cell factor 1，TCF1）、GFP和CD4基因?qū)嵤┝嘶蚓庉?。通過(guò)體外培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化，LSK細(xì)胞和DN細(xì)胞被誘導(dǎo)分化為下游細(xì)胞，在分化的下游細(xì)胞中檢測(cè)到基因編輯效果。

1 材料與方法

1.1 材料

HEK293T細(xì)胞、OP9細(xì)胞、OP9-DL細(xì)胞和NIH3T3細(xì)胞均為本實(shí)驗(yàn)留存細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)室所使用的OP9細(xì)胞穩(wěn)定感染了含有GFP標(biāo)記基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒（MSCV）。而OP9-DL細(xì)胞也感染了逆轉(zhuǎn)錄病毒，但其中含有Notch信號(hào)配體和GFP標(biāo)記基因。純合子SpCas9敲入小鼠購(gòu)自The Jackson Laboratory公司。pLenti-CRISPR v2載體購(gòu)自Addgene公司（#52961）。pMSCV-IRES-hNGFR載體和pMSCV-IRES-Thy1.1載體為本實(shí)驗(yàn)室留存載體。流式細(xì)胞術(shù)抗體購(gòu)自eBioscience公司或BioLegend公司。引物購(gòu)自IDT公司。

1.2 方法

1.2.1 sgRNA載體構(gòu)建 選取4個(gè)基因Luciferase（Luc）、GFP、CD4和Tcf7，使用美國(guó)麻省理工學(xué)院在線CRISPR/Cas設(shè)計(jì)軟件（http://crispr.mit.edu：8079/？）設(shè)計(jì)相應(yīng)的sgRNA（表1）。按照pLenti-CRISPR v2載體操作說(shuō)明［14-15］，完成sgRNA的克隆構(gòu)建工作。通過(guò)PCR方法從pLenti-CRISPR-sgRNA載體上克隆U6-sgRNA-EF1α基因片段，使用BglII和NcoI雙酶切方法將該基因片段亞克隆至逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMSCV-hNGFR中，從而得到pMSCVU6-sgRNA-EF1α-hNGFR載體。sgRNA載體上包含人hNGFR（human CD271，human nerve growth factor receptor）表面抗原報(bào)告基因，可以使用Anti-hNGFR抗體染色并檢測(cè)（圖1-B）。使用無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒（QIAGEN）抽提質(zhì)粒備用。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) HEK293T細(xì)胞和NIH3T3細(xì)胞使用DMEM培養(yǎng)基（Thermo Fisher Scientific），培養(yǎng)基中額外加入10%胎牛血清（Atlanta Biologicals），Pen-Strep抗 生 素 和L-Glutamine（Thermo Fisher Scientific）。DMEM培養(yǎng)基相關(guān)成分混合均勻后過(guò)濾除菌，置于4℃冰箱備用。OP9細(xì)胞和OP9-DL細(xì)胞使用 MEM-α培養(yǎng)基（Thermo Fisher Scientific），培養(yǎng)基中額外加入10%胎牛血清，Pen-Strep抗生素和L-Glutamine。MEM-α培養(yǎng)基相關(guān)成分混合均勻后過(guò)濾除菌，置于4℃冰箱備用。

表1 sgRNA靶點(diǎn)序列

1.2.3 病毒包裝及滴度測(cè)定 第1天晚上，在10 cm培養(yǎng)皿中種上400萬(wàn)HEK293T細(xì)胞。第2天早上，使 用 Lipofectamine 3000（Thermo Fisher Scientific）進(jìn)行轉(zhuǎn)染。對(duì)于sgRNA病毒，每個(gè)10 cm平皿轉(zhuǎn)染5 μg pMSCV-U6-sgRNA-EF1α-hNGFR 質(zhì)粒和 5 μg 逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝質(zhì)粒（本實(shí)驗(yàn)室留存）。轉(zhuǎn)染24 h后換液，加入5 mL新鮮配制的DMEM培養(yǎng)基。換液后作為零點(diǎn)開(kāi)始計(jì)時(shí)，24 h后第1次收取病毒并加入5 mL新鮮培養(yǎng)基，48 h后第2次收取病毒。收集病毒后，立即使用Retro-X Concentrator（Clontech）對(duì)病毒進(jìn)行濃縮處理，然后放入-80冰箱凍存。

病毒滴度測(cè)定。第1天晚上，在6孔板中種上NIH-3T3細(xì)胞，每孔20萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。第2天使用“培養(yǎng)基-病毒混合液”替換舊培養(yǎng)基：對(duì)于每個(gè)孔，使用1 948 μL新鮮培養(yǎng)基，加入50 μL濃縮后的病毒和 2 μL 的 Polybrene（終濃度為 10 μg/mL）?；旌暇鶆虿⑦B續(xù)培養(yǎng)48 h后，使用Anti-hNGFR抗體染色并經(jīng)流式細(xì)胞儀分析確定病毒滴度。

1.2.4 OP9細(xì)胞中基因編輯 在6孔板中種上10萬(wàn)個(gè)OP9細(xì)胞，加入Cas9病毒（本實(shí)驗(yàn)室留存）和GFP-sgRNA-1病毒。培養(yǎng)3 d后，取樣品使用流式細(xì)胞儀分析OP9細(xì)胞中GFP表達(dá)量。培養(yǎng)7 d后，取樣品使用流式細(xì)胞儀分析OP9細(xì)胞中GFP表達(dá)量。持續(xù)培養(yǎng)，并每隔3 d檢測(cè)GFP表達(dá)狀況變化。培養(yǎng)3周后，使用流式細(xì)胞儀將Thy1.1+hNGFR-（Cas9+sgRNA-），Thy1.1+hNGFR+（Cas9+sgRNA+），Thy1.1-hNGFR-（Cas9-sgRNA-）和 Thy1.1-hNGFR+（Cas9-sgRNA+）4個(gè)細(xì)胞群體分選出來(lái)并單獨(dú)培養(yǎng)。使用熒光顯微鏡觀察4個(gè)細(xì)胞群體的GFP表達(dá)情況。抽提Thy1.1+hNGFR+（Cas9+sgRNA+）細(xì)胞的基因組DNA，克隆GFP片段并測(cè)序。

1.2.5 DN細(xì)胞基因編輯及檢測(cè) 取純合子Cas9敲入小鼠（敲入位點(diǎn)為Rosa26，pCAG-hSpCas9-P2AEGFP，后簡(jiǎn)稱Rosa26-Cas9小鼠）［16］，解剖提取其胸腺分離出胸腺中的細(xì)胞（GFP+）。使用Biotin標(biāo)記的Anti-CD4抗體和Anti-CD8抗體（eBioscience）與胸腺細(xì)胞在冰上孵育20 min，之后使用BioMag?Streptavidin磁珠（QIAGEN）分離得到DN細(xì)胞。使 用 sgRNA（Luc-sgRNA-1，GFP-sgRNA-2，CD4-sgRNA-1）病毒感染DN細(xì)胞，而后37℃培養(yǎng)過(guò)夜。第2天早上除去病毒，并將DN細(xì)胞轉(zhuǎn)移到預(yù)先輻射處理過(guò)（30-Gray）的OP9-DL細(xì)胞上進(jìn)行共培養(yǎng)，在培養(yǎng)基中加入IL-7和Flt-3細(xì)胞因子（PEPROTECH），誘導(dǎo)DN細(xì)胞分化為下游T細(xì)胞。每隔3 d更換一半培養(yǎng)基并補(bǔ)充細(xì)胞因子。連續(xù)培養(yǎng)7 d后，隨后進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析（圖1-C）。

1.2.6 LSK細(xì)胞基因編輯及檢測(cè) 取純合子Cas9敲入小鼠，解剖并分離其骨髓。使用ACK細(xì)胞裂解液（ThermoFisher）裂解紅細(xì)胞。加入Mouse-Rat血清，冰上孵育20 min。加入使用Biotin標(biāo)記的Anti-Mac1、Anti-Ter119和Anti-Gr1抗體與骨髓細(xì)胞在冰上孵育30 min。之后使用PBS緩沖液將未結(jié)合的抗體洗掉。將骨髓細(xì)胞與BioMag? Streptavidin磁珠混合，在4℃冷房中上下旋轉(zhuǎn)孵育30 min。使用磁鐵將磁珠清除。使用Anti-Sca1，Anti-Kit及Anti-Linage Cocktail（Lin）抗體對(duì)分離的骨髓細(xì)胞進(jìn)行染色，冰上孵育20 min后使用PBS緩沖液將未結(jié)合的抗體洗掉。使用流式細(xì)胞儀將Lin-Sca1+Kit+細(xì)胞分選出來(lái)，并立即感染sgRNA病毒（TCF1-sgRNA-1，TCF1-sgRNA-2，GFP-sgRNA-2）或者空載體病毒（MSCV-Thy1.1）。補(bǔ)充必要的血清、Pen-Strep雙抗、L-Glutamine及細(xì)胞因子（IL3、IL6、Flt3和 SCF，PEPROTECH），而后37℃培養(yǎng)過(guò)夜。第2天早上離心后除去病毒液，在MEM-α培養(yǎng)基中加入血清、Pen-Strep雙抗、L-Glutamin及細(xì)胞因子（IL3、IL6、Flt3和SCF），而后37℃培養(yǎng)24 h。由于sgRNA病毒包含有hNGFR報(bào)告基因，而空載病毒包含Thy1.1報(bào)告基因，抗體孵育后使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行第2次分選，分別將hNGFR（sgRNA）陽(yáng)性的細(xì)胞，以及Thy1.1（對(duì)照組，無(wú)sgRNA）陽(yáng)性的細(xì)胞分選出來(lái)。將hNGFR+細(xì)胞和Thy1.1+細(xì)胞按照3∶1的比例混合。之后，將混合的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到預(yù)先輻射（30 Gray）處理過(guò)的OP9-DL細(xì)胞上進(jìn)行共培養(yǎng)，在培養(yǎng)基中加入IL-7和Flt-3細(xì)胞因子。將hNGFR+細(xì)胞和預(yù)先輻射（30 Gray）處理過(guò)的OP9細(xì)胞上進(jìn)行共培養(yǎng)。每隔3 d更換一半培養(yǎng)基并補(bǔ)充相應(yīng)的細(xì)胞因子，連續(xù)培養(yǎng)兩周。之后，進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析（圖1-C）。

A：造血干細(xì)胞分化發(fā)育簡(jiǎn)要示意圖［1-2］，相關(guān)細(xì)胞大小比例及形狀不代表真實(shí)情況。造血干細(xì)胞分化后，主要形成兩大分支：髓系細(xì)胞和淋巴系細(xì)胞（HSC：Hematopoietic stem cell，造血干細(xì)胞；MPP：Multipotent progenitor，多潛能祖細(xì)胞；CMP：Common myeloid progenitor，共同髓系前體細(xì)胞；CLP：Common lymphoid progenitor，共同淋巴系前體細(xì)胞；MEP：Megakaryocyte-erythroid progenitor，“巨核細(xì)胞/紅細(xì)胞前體細(xì)胞；GMP：Granulocyte-macrophage progenitor，粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞前體細(xì)胞；DC：Dendritic cell，樹(shù)突狀細(xì)胞；ETP：Early T-cell Precursor，早期T細(xì)胞前體細(xì)胞；DN：CD4-CD8- Double negative cell，DN細(xì)胞；DP：CD4+CD8+ double positive T cell，DP細(xì)胞；EILP：Early innate lymphoid progenitor，固有淋巴樣細(xì)胞前體細(xì)胞；ILC：Innate lymphoid cell，固有淋巴樣細(xì)胞；NK：Natural killer cell，自然殺傷細(xì)胞）；B：sgRNA載體結(jié)構(gòu)示意圖。sgRNA由U6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)，hNGFR報(bào)告基因由EF1α啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)；C：實(shí)驗(yàn)操作方法示意圖。首先從Cas9敲入小鼠體內(nèi)分離得到DN細(xì)胞或LSK細(xì)胞，通過(guò)感染逆轉(zhuǎn)錄病毒獲得陽(yáng)性感染細(xì)胞。在體外培養(yǎng)并誘導(dǎo)分化后，使用流式細(xì)胞儀分析基因編輯結(jié)果

2 結(jié)果

2.1 MSCV-CRISPR系統(tǒng)測(cè)試

為了檢驗(yàn)新構(gòu)建的基于MSCV載體的CRISPR/Cas系統(tǒng)是否能夠進(jìn)行基因編輯，選擇GFP為靶標(biāo)基因，在持續(xù)表達(dá)GFP的OP9細(xì)胞系中進(jìn)行敲除GFP的測(cè)試。將Cas9病毒和GFP-sgRNA-1病毒共感染到OP9細(xì)胞，7 d后通過(guò)流式細(xì)胞儀分析，只有Thy1.1+hNGFR+（Cas9+sgRNA+）細(xì)胞群體的GFP強(qiáng)度顯著下降（圖2-A）。使用流式細(xì)胞儀將Cas9+sgRNA+細(xì)胞群體分離出，克隆GFP靶點(diǎn)片段并測(cè)序，發(fā)現(xiàn)在靶點(diǎn)處有短的缺失或插入等變異（圖2-B）。這些結(jié)果表明，在OP9細(xì)胞中，由MSCV載體介導(dǎo)的基因編輯真實(shí)可信。

圖2 OP9細(xì)胞中基因編輯結(jié)果

2.2 DN細(xì)胞基因編輯結(jié)果

相對(duì)于從小鼠骨髓分離LSK細(xì)胞而言，從小鼠胸腺中分離DN細(xì)胞操作十分容易，且易于獲取大量的細(xì)胞。因此，我們選用Cas9敲入小鼠，首先從中分離了DN細(xì)胞（GFP+）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。分別感染了3種sgRNA（Luc-sgRNA-1，GFP-sgRNA-2，CD4-sgRNA-1）以靶向熒光素酶基因（Luc）、GFP和CD4。與Luc-sgRNA-1和CD4-sgRNA-1基因編輯結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，只有GFP-sgRNA-2基因編輯后出現(xiàn)GFP-細(xì)胞群體。與Luc-sgRNA-1和GFP-sgRNA-2基因編輯結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，只有CD4-sgRNA-1基因編輯后下游細(xì)胞中CD4+細(xì)胞比例大幅下降，同時(shí)CD8+細(xì)胞比例卻大幅增加（圖3）。這一結(jié)果表明，使用Cas9敲入小鼠，以逆轉(zhuǎn)錄病毒作為載體，可以在小鼠原代DN細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)基因編輯。

圖3 DN細(xì)胞體外基因編輯結(jié)果

2.3 LSK細(xì)胞基因編輯結(jié)果

在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，針對(duì)LSK細(xì)胞進(jìn)行了基因編輯測(cè)試。我們使用Cas9敲入小鼠進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)，并通過(guò)流式細(xì)胞儀分選出LSK細(xì)胞。隨后，分別感染 了 3種 sgRNA（TCF1-sgRNA-1，TCF1-sgRNA-2，GFP-sgRNA-2）以靶向Tcf7和GFP。由于敲除TCF1后，LSK細(xì)胞不能正常分化為下游T細(xì)胞［17］。因此，我們加入了感染空病毒（MSCV-Thy1.1）的LSK細(xì)胞作為內(nèi)參。體外培養(yǎng)時(shí)，使用3∶1的比例進(jìn)行共培養(yǎng)。在GFP-sgRNA-2基因編輯組中，經(jīng)過(guò)2周體外培養(yǎng)后，hNGFR陽(yáng)性細(xì)胞與Thy1.1細(xì)胞比例變?yōu)?.5∶1（29.5%∶8.54%）。這一比例與初始培養(yǎng)時(shí)3∶1的比例接近。而在TCF1-sgRNA-1基因編輯組中，hNGFR陽(yáng)性細(xì)胞與Thy1.1細(xì)胞比例變?yōu)?∶7.7（2.31%∶17.7%）。在TCF1-sgRNA-2基因編輯組中，hNGFR陽(yáng)性細(xì)胞與Thy1.1細(xì)胞比例變?yōu)?∶3.6（3.83%∶13.7%）（圖 4-A）。將感染了Tcf7基因sgRNA病毒的LSK細(xì)胞與OP9細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，LSK細(xì)胞會(huì)發(fā)育為髓系免疫細(xì)胞。由于TCF1對(duì)于髓系免疫細(xì)胞發(fā)育非必需，因此當(dāng)TCF1被敲除后，骨髓系免疫細(xì)胞發(fā)育不受影響［17］。在實(shí)驗(yàn)中，在GFP-sgRNA-2，TCF1-sgRNA-1，TCF1-sgRNA-2 三個(gè)基因編輯組中，都有高比例的hNGFR陽(yáng)性細(xì)胞（41.8%∶49.9%∶40.0%）（圖4-B）。這些hNGFR陽(yáng)性細(xì)胞都有高比例的Mac1陽(yáng)性細(xì)胞（結(jié)果未展示）。這表明，使用MSCV病毒為載體可以在Cas9敲入小鼠的LSK細(xì)胞中有效實(shí)施基因編輯。

圖4 LSK細(xì)胞體外基因編輯結(jié)果

3 討論

本研究從Cas9敲入小鼠中分離相關(guān)造血干細(xì)胞和免疫前體細(xì)胞，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒（MSCV）作為載體實(shí)施了基因編輯。在能夠感染MSCV病毒的情況下，這一方法可能適用于大鼠等親緣關(guān)系較近的哺乳動(dòng)物。雖然使用MSCV病毒載體可以高效感染LSK和DN細(xì)胞，但病毒穩(wěn)定整合到細(xì)胞基因組中，并持續(xù)不斷地表達(dá)可能會(huì)對(duì)LSK細(xì)胞和DN胞分化發(fā)育造成不利影響，并引發(fā)更多的脫靶效應(yīng)。未來(lái)可以考慮構(gòu)建可以被誘導(dǎo)表達(dá)的CRISPR/Cas統(tǒng)，或者采用非整合病毒載體來(lái)介導(dǎo)實(shí)施基因編輯。此外，從Cas9敲入小鼠中分離相應(yīng)細(xì)胞實(shí)施基因編輯，在一定程度上限制了這一方法的應(yīng)用。未來(lái)可以構(gòu)建同時(shí)含有Cas9和sgRNA表達(dá)元件的病毒載體，將有助于解決這一問(wèn)題。

在LSK細(xì)胞中實(shí)施基因編輯并在體外誘導(dǎo)其分化，這一技術(shù)平臺(tái)的建立有助于研究造血干細(xì)胞早期分化發(fā)育分子機(jī)制。由于造血干細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中具有最高的分化潛能，在其中實(shí)施基因編輯，其下游細(xì)胞都會(huì)繼承相同的遺傳學(xué)特征。這使得我們?cè)趯?duì)特定基因?qū)嵤┣贸?，可以在更廣的范圍內(nèi)研究該基因?qū)γ庖呦到y(tǒng)其他細(xì)胞分化發(fā)育的影響。本研究中只介紹了在體外環(huán)境中針對(duì)LSK和DN細(xì)胞實(shí)施基因編輯的研究結(jié)果，缺乏小鼠個(gè)體水平實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果。如果能夠?qū)⑦@一技術(shù)方法延伸，將相關(guān)基因編輯的LSK細(xì)胞移植到受體小鼠體內(nèi)，并利用體內(nèi)環(huán)境誘導(dǎo)編輯后的LSK細(xì)胞分化發(fā)育重建免疫系統(tǒng)，這將極大提升這一方法的價(jià)值和意義。此外，近年來(lái)單細(xì)胞組學(xué)技術(shù)快速發(fā)展，高通量單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)方法也成功建立［18-19］。綜合運(yùn)用這些技術(shù)方法將推動(dòng)免疫細(xì)胞發(fā)育研究快速向前發(fā)展。

4 結(jié)論

從Cas9敲入小鼠中分離原代LSK細(xì)胞或DN細(xì)胞，使用逆轉(zhuǎn)錄病毒作為載體將sgRNA表達(dá)元件導(dǎo)入到相應(yīng)細(xì)胞中引發(fā)基因編輯。在DN細(xì)胞中成功敲除GFP和CD4表面抗原的表達(dá)；在LSK細(xì)胞中成功敲除T細(xì)胞分化關(guān)鍵因子TCF1的表達(dá)。

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