史晨燕，李浩鵬，劉睿媛，耿會(huì)玲

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 化學(xué)與藥學(xué)院，陜西 楊陵 712100)

香豆素是一類具有α-苯并吡喃酮結(jié)構(gòu)的天然產(chǎn)物，其廣泛分布于傘形科、蕓香科、桑科等高等植物及微生物代謝產(chǎn)物中[1]，不僅是藥用植物的主要活性成分之一，而且具有豐富多樣的生理活性，如抗腫瘤、抗氧化、抗菌、抗HIV、抗炎、抗癌、抗凝血等[2-5]。此外，該類化合物也被廣泛應(yīng)用于熒光染料、激光染料、熒光增白劑、發(fā)光材料、熒光探針及非線性光學(xué)材料等[6-7]領(lǐng)域。1978年，M.Berenbaum[8]首次報(bào)道了花椒毒素這一典型香豆素對(duì)植食性昆蟲的光活化毒性，引起了人們對(duì)天然香豆素在農(nóng)作物病菌和害蟲防治方面研究的關(guān)注。蛇床子素不僅對(duì)常見農(nóng)作物的植物病原真菌具有廣譜抑制活性[9-12]，還對(duì)菜青蟲、小菜蛾幼蟲等害蟲具有觸殺作用[13]，是香豆素類化合物在農(nóng)業(yè)上成功應(yīng)用的典范。此后，掀起了從香豆素類化合物中篩選“低毒、高效、低殘留”生物農(nóng)藥的熱潮。但天然香豆素在植物中含量較低，無(wú)法滿足市場(chǎng)需求，限制了它們的廣泛應(yīng)用，因此，借助化學(xué)合成實(shí)現(xiàn)其規(guī)模化生產(chǎn)。該類化合物的經(jīng)典合成方法有Perkin反應(yīng)、Wittig反應(yīng)、Pechmann反應(yīng)等[14-16]，近年來(lái)又發(fā)展了Mukaiyama酯化反應(yīng)、多米諾反應(yīng)、微波輔助法等簡(jiǎn)潔、高效、綠色的新合成方法[17-19]。

本研究以取代水楊醛即鄰羥基苯甲醛為原料，在有機(jī)堿催化下[20]，采用改進(jìn)的Knoevenagel縮合法合成了15種3-香豆素甲酸乙酯類化合物，并測(cè)定其對(duì)12種常見植物病原真菌的抑制活性，為香豆素類抗菌素的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 供試的馬鈴薯干腐(Fusariumsolani,縮寫為FS)、蘋果輪紋(Botryosphaeriadothidea,縮寫為BD)、玉米彎孢(Curvularialunata,縮寫為CL)、棉花枯萎(Fusariumoxysporumf.sp.Vasinfectum,縮寫為FOV)、蘋果炭疽(Colletotrichumgloeosporioides,縮寫為CG)、蘋果腐爛(Valsamali,縮寫為VM)、西瓜枯萎(Fusariumoxysporumsp.niveum,縮寫為FON)、小麥赤霉(Fusariumgraminearum,縮寫為FG)、白菜黑斑(Alternariabrassicae,縮寫為AB)、煙草赤星(Alternariaalternate,縮寫為AA)、南瓜枯萎(Fusariumbulbigenum,縮寫為FB)和水稻稻瘟菌(Pyriculariaoryza,縮寫為PO)等12種植物病原真菌均由西北農(nóng)林科技大學(xué)無(wú)公害農(nóng)藥研究中心提供。

1.1.2 儀器與試劑 XT-4顯微熔點(diǎn)儀(溫度計(jì)未校正，北京泰克儀器有限公司)，Bruker AVANCE III 500 MHz核磁共振儀(德國(guó)Bruker公司)，F(xiàn)innigan Trace質(zhì)譜儀(美國(guó)Themo Finnigan公司)。

醚菌酯(Kresoxim-methyl，縮寫為KM，≥99%)，阿拉丁試劑股份有限公司；DMSO，成都市科龍化工試劑廠；瓊脂粉，北京索萊寶科技有限公司；葡萄糖，廣東光華科技股份有限公司；取代水楊醛，北京伊諾凱試劑公司；醫(yī)用酒精、丙二酸二乙酯、哌啶、無(wú)水乙醇等均為市售分析純?cè)噭?/p>

1.2 目標(biāo)化合物的合成

以哌啶為催化劑，使取代鄰羥基苯甲醛(取代水楊醛)與含有活潑亞甲基的丙二酸二乙酯在無(wú)水乙醇中發(fā)生縮合反應(yīng)，得到取代3-香豆素甲酸乙酯A1～A15，合成路線見圖1。

圖1 目標(biāo)化合物的合成路線Fig.1 Synthetic route for the target compounds

以化合物A1即3-香豆素甲酸乙酯的合成為例[21]：向干燥的圓底燒瓶中依次加入水楊醛(4.9 g,4.3 mL,40 mmol)、丙二酸二乙酯(7.25 g,6.8 mL,45 mmol)、25 mL無(wú)水乙醇、0.5 mL哌啶和1～2滴冰醋酸，裝上冷凝管和干燥管后加熱至回流；TLC跟蹤檢測(cè)，2 h后反應(yīng)完全。待反應(yīng)液冷卻至室溫后轉(zhuǎn)入錐形瓶?jī)?nèi)，向其中加入3～5 mL水，冰水浴冷卻使產(chǎn)物完全析出；減壓抽濾，產(chǎn)物用冷卻的50%乙醇洗滌2次(每次3～5 mL)，抽干，得白色晶體。用乙醇∶水=1∶3(v∶v)重結(jié)晶，稱重，得7.3 g產(chǎn)物，產(chǎn)率為83.4%。以相應(yīng)的取代水楊醛為原料，采用相同的方法合成A2～A15。

1.3 結(jié)構(gòu)表征

用顯微熔點(diǎn)儀測(cè)定了化合物A1～A15的熔點(diǎn)，采用質(zhì)譜(ESI-MS)和核磁共振譜(1H NMR、13C NMR)對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。

1.4 體外抗菌活性測(cè)定

采用菌絲線性生長(zhǎng)速率法測(cè)定了所有化合物對(duì)馬鈴薯干腐、蘋果輪紋、玉米彎孢等12種植物病原真菌的抑制活性[22-25]。以50 μg·mL-1的醚菌酯溶液為陽(yáng)性對(duì)照，以5%的DMSO水溶液作為空白對(duì)照，將已準(zhǔn)確稱量的待測(cè)化合物完全溶于5%(v/v)的DMSO水溶液中，將10 mL待測(cè)液或?qū)φ找号c90 mL無(wú)菌PDA培養(yǎng)基在50℃快速混勻，得到濃度為50 μg·mL-1的含藥液；將其趁熱倒入已滅菌的培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿10 mL，冷卻備用。把供試病原菌(菌餅直徑5 mm)接種到上述培養(yǎng)皿中，每個(gè)測(cè)試組設(shè)3個(gè)平行；將其置于濕度為60%、28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑(mm)，按式(1)計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率(inhibition rate,IR)：

IR(%)=[(dc-d0)-(ds-d0)]/(dc-d0)×100

(1)

式中：d0為菌餅直徑(5 mm)，dc為空白對(duì)照組菌落平均直徑，ds為樣品組菌落平均直徑(mm)。

設(shè)7個(gè)濃度，采用相同方法測(cè)定A6及陽(yáng)性對(duì)照的EC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 3-香豆素甲酸乙酯類化合物的結(jié)構(gòu)表征

采用上述方法合成了15種3-香豆素甲酸乙酯類化合物(A1～A15)，其物理性質(zhì)和質(zhì)譜(ESI-MS)數(shù)據(jù)見表1，核磁共振氫譜和碳譜(1H NMR和13C NMR)數(shù)據(jù)見表2。

由表2可知：在1H NMR譜中，所有化合物在δH8.49～8.96范圍內(nèi)都出現(xiàn)單峰，這是4號(hào)碳上氫原子的信號(hào)峰。此外，A系列化合物在δH4.45～4.36范圍內(nèi)均出現(xiàn)4重峰，這是乙基中亞甲基上的氫信號(hào)；在δH1.43～1.39范圍內(nèi)出現(xiàn)3重峰，這是乙基中甲基上的氫信號(hào)；它們的耦合常數(shù)均為7.1 Hz。在13C NMR譜中，所有化合物在δC162.1～165.1和δC154.6～161.9范圍內(nèi)出現(xiàn)2個(gè)酯羰基信號(hào)峰。

表1目標(biāo)化合物的物理性質(zhì)及質(zhì)譜數(shù)據(jù)
Table 1 Physical properties and ESI-MS data of the target compounds

化合物取代基R熔點(diǎn)/℃物態(tài)(室溫)CAS號(hào)收率質(zhì)譜ESI-MS m/z預(yù)測(cè)值測(cè)量值A(chǔ)1H89.0～92.7白色晶體1846-76-083218.21219.02 [M+H]+A28-CH342.3～43.6黃色固體17349-63-285232.24255.09 [M+Na]+A37-CH375.1～76.5黃色固體327613-94-588232.24255.17 [M+Na]+A46-CH3102.0～104.3淡黃色固體54396-24-688232.24255.13 [M+Na]+A58-OCH387.1～89.3白色固體1729-02-892248.23271.87 [M+Na]A67-OCH3133.6～134.8白色固體6093-72-789248.23271.90 [M+Na]+A76-OCH3139.8～141.0黃色固體41459-71-688248.23271.13 [M+Na]+A88-OH173.3～174.6白色固體108170-58-789234.21490.73 [2M+Na]+A97-OH166.3～167.2淡黃色固體6093-71-687234.21490.77 [2M+Na]+A106-OH184.0～185.8棕色固體70160-51-986234.21490.75 [2M+Na]+A118-F92.5～93.7黃色固體1821196-31-986236.20259.14 [M+Na]+A126-F87.5～88.4淡黃色固體70384-81-590236.20259.20 [M+Na]+A136-Cl159.2～160.5黃色固體70384-80-488252.65274.84 [M+Na]+A146-Br170.2～171.3淡黃色固體2199-90-893297.10616.57 [2M+Na]+A156-NO2198.5～199.3黃色固體13373-28-992263.21550.68 [2M+Na]+

2.2 目標(biāo)化合物抗菌活性初篩結(jié)果

測(cè)定了15種目標(biāo)化合物在50 μg·mL-1時(shí)對(duì)12種供試菌的體外抑制活性，結(jié)果見表3。由表3可知：大多數(shù)目標(biāo)化合物在50 μg·mL-1對(duì)供試菌具有不同程度的抑制活性。相比較而言，供試化合物對(duì)蘋果腐爛、蘋果炭疽、蘋果輪紋病原菌的抑制活性較高，說(shuō)明這3種菌為其敏感菌株。苯環(huán)上引入取代基有助于提高活性，但給電子取代基的化合物的抑菌活性大都高于吸電子取代基者，如7-甲氧基取代的A6對(duì)蘋果腐爛病原菌的抑制活性最高，我們采用相同方法測(cè)定了其對(duì)2種敏感菌的毒力方程和EC50值。

由表4可知：A6對(duì)蘋果腐爛病原菌的EC50值(65.4 μg·mL-1)高于陽(yáng)性對(duì)照醚菌酯(84.7 μg·mL-1)，但對(duì)蘋果輪紋病原菌的活性遠(yuǎn)低于醚菌酯。

3 結(jié)論與討論

采用Knoevenagel縮合法實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)化合物的合成，通過(guò)ES-IMS和NMR譜確認(rèn)了它們的結(jié)構(gòu)。在母核6/7/8位即苯環(huán)不同位置引入給電子取代基甲基、甲氧基、羥基或吸電子取代基氟、氯、溴和硝基，以豐富3-香豆素甲酸乙酯類化合物并考察不同類型取代基對(duì)其抗真菌活性的影響。其初步構(gòu)效關(guān)系為：1)對(duì)絕大多數(shù)供試菌而言，無(wú)論向苯環(huán)引入吸電子取代基還是給電子取代基，對(duì)該類化合物的抗菌活性均有不同程度的提高；2)相比較而言，帶有給電子取代基化合物的抗菌活性基本高于吸電子取代基者，如7-OCH3取代產(chǎn)物A6的活性總體較高，而6-NO2取代產(chǎn)物A15的活性普遍較低；3)對(duì)于帶給電子取代基的產(chǎn)物而言，不同取代基對(duì)活性的影響順序大致為甲氧基>甲基>羥基；對(duì)于同一取代基而言，其活性順序?yàn)?位>6位>8位；4)對(duì)于吸電子取代基而言，6-NO2取代產(chǎn)物A15的活性大都<鹵素取代產(chǎn)物的活性；5)A6對(duì)蘋果腐爛病原菌的活性最高，其EC50值(65.4 μg·mL-1)>陽(yáng)性對(duì)照醚菌酯(84.7 μg·mL-1)。

表2 目標(biāo)化合物的1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)Table 2 The 1H NMR and 13C NMR data of the target compounds

3-香豆素甲酸乙酯類化合物是農(nóng)用抗菌劑家族中的新成員，雖然關(guān)于香豆素類化合物的合成及其生物活性的研究已有報(bào)道[26-27]，但目前尚沒有對(duì)該類化合物抗菌活性的系統(tǒng)研究，母核同一位置的不同取代基對(duì)其活性的影響、同一取代基在不同位置對(duì)其活性的影響、大位阻取代基對(duì)其活性的影響規(guī)律并不清楚，不同類型香豆素的抗菌譜及其作用機(jī)制也尚不明確，這有待于我們進(jìn)一步深入研究。

表3 目標(biāo)化合物抗真菌活性初測(cè)結(jié)果(50 μg·mL-1,72 h)Table 3 Results of preliminary antifungal activities of title compounds (50 μg·mL-1,72 h)

表4 化合物A6對(duì)部分供試病菌的毒力方程及EC50值Table 4 Toxicity regression equations and EC50 values of A6 against tested fungi μg·mL-1

注：*公式中y:抑制率的幾率值；x:lgC(pg·mL-1)。

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