萬光俊，方大正，沈豐，吳紅偉，周文波

（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院 普通外科，湖北 十堰 442000）

暫時(shí)性和永久性甲狀旁腺功能低下是甲狀腺外科的常見并發(fā)癥，有文獻(xiàn)[1-2]報(bào)道其發(fā)生率分別為14%～60%和4%～11%。因此,術(shù)中甲狀旁腺的識(shí)別與保護(hù)尤其重要，除了細(xì)致的解剖保護(hù)甲狀旁腺及其血供，甲狀旁腺自體移植已越來越多地采用以保留甲狀旁腺功能[3]。在手術(shù)中及自體移植之前必須判定甲狀旁腺組織，以免發(fā)生誤切、錯(cuò)誤移植和錯(cuò)誤保留轉(zhuǎn)移癌組織。筆者自2016年1月采用術(shù)中無染色明視野鏡檢法判定甲狀旁腺組織，與傳統(tǒng)術(shù)中冷凍病理檢測比較，旨在評(píng)定無染色明視野鏡檢法判定甲狀旁腺組織準(zhǔn)確性和臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2016年1月—2017年6月期間，筆者所在醫(yī)療組連續(xù)收治并行手術(shù)治療的357例甲狀腺乳頭狀癌患者，排除術(shù)中已經(jīng)明確甲狀旁腺患者，將術(shù)中需要判定的疑似下甲狀旁腺組織的115例甲狀腺癌患者納入研究對(duì)象。其中男28例，女87例；年齡14～68歲，平均年齡（46.3±8.6）歲；TNM分期I期69例，II期17例，III期23例，IV期6例；行甲狀腺全切38例，甲狀腺全切+單側(cè)中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃51例，甲狀腺全切+雙側(cè)中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃20例，甲狀腺全切+雙側(cè)中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃+側(cè)頸區(qū)淋巴結(jié)清掃6例。

1.2 方法

手術(shù)由同一組醫(yī)生施行，術(shù)中獲取肉眼判斷115例的疑似下甲狀旁腺組織196枚，對(duì)術(shù)中找到疑似甲狀旁腺組織后，由第一助手取疑似甲狀旁腺組織的一小部分約2 mm3，均等分成2份，1份用生理鹽水沖洗，放在載玻片上，以蓋玻片壓碎組織[4]。立即送病理科行400倍鏡明視野鏡檢。記錄從制作玻璃壓片到出病理報(bào)告所耗時(shí)間。對(duì)另1份送術(shù)中冷凍病理，記錄送檢到出病理報(bào)告所耗時(shí)間。與無染色明視野鏡檢判定結(jié)果進(jìn)行比較。

每例患者術(shù)前第1天、術(shù)后1、3 0 d均測定血清全段甲狀旁腺激素（intact parathyroid hormone，iPTH）和血清鈣水平,評(píng)價(jià)術(shù)前術(shù)后的甲狀旁腺功能變化。iPTH采用化學(xué)發(fā)光法測定（貝克曼DX1800生化儀），正常參考值范圍為（12～88）pg/mL。血清鈣采用偶氮砷III法（雅培C16000全自動(dòng)分析儀），正常參考值范圍為（2.11～2.52）mmol/L。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，無染色明視野鏡檢法與術(shù)中冷凍病理檢查方法的一致性檢驗(yàn)采用κ檢驗(yàn)，即κ值（0＜κ≤1）越大，一致性越強(qiáng)，＜0.2，一致性非常弱；0.4≤κ＜0.6，一致性一般：0.6≤κ＜0.8，一致性好；κ＞0.8，一致性非常強(qiáng)，κ=1完全一致。無染色明視野鏡檢法與術(shù)中冷凍病理檢查判定結(jié)果是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異采用配對(duì)χ2檢驗(yàn)（McNemar檢驗(yàn)）；術(shù)前術(shù)后甲狀旁系腺功能的變化采用配對(duì)t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 術(shù)中無染色明視野鏡檢結(jié)果和術(shù)中冷凍結(jié)果

無染色明視野鏡檢法400倍顯微鏡下各種組織特點(diǎn)：甲狀旁腺組織特點(diǎn)是可見特征性的褐色小細(xì)胞密集團(tuán)廣泛分布，透明脂肪細(xì)胞散在其中（圖1A）;脂肪組織特點(diǎn)是脂肪細(xì)胞密集成團(tuán)，相互重疊（圖1B）；淋巴結(jié)的特點(diǎn)是脂肪聚集成團(tuán)，白色小細(xì)胞密集團(tuán)片狀分布，白色小細(xì)胞團(tuán)體積較甲狀旁腺中褐色小細(xì)胞密集團(tuán)大（圖1C）；胸腺組織特點(diǎn)是與脂肪組織相似，除了脂肪細(xì)胞密集成團(tuán)相互重疊外，還有少量白色小細(xì)胞散在其中（圖1D）。

196枚疑似甲狀旁腺組織無染色明視野鏡檢法判定結(jié)果見表1。其中無染色明視野鏡檢法判定甲狀旁腺組織為142枚，術(shù)中冷凍病理證實(shí)均為甲狀旁腺；無染色明視野鏡檢法判定的29枚脂肪組織中，術(shù)中冷凍病理判定為脂肪有25枚，甲狀旁腺1枚，胸腺1枚，淋巴結(jié)2枚；無染色明視野鏡檢法判定的17枚淋巴組織中，術(shù)中冷凍病理判定淋巴結(jié)有14枚，甲狀旁腺2枚，胸腺1枚；無染色明視野鏡檢法判定的胸腺組織8枚中，術(shù)中冷凍病理判定胸腺有5枚，甲狀旁腺1枚，脂肪2枚。因此，術(shù)中冷凍病理共檢測出甲狀旁腺146枚，脂肪27枚，淋巴結(jié)16枚，胸腺7枚（表1）。甲狀旁腺組織均順利壓片平均耗時(shí)為4～6 min，送術(shù)中冷凍耗時(shí)約30～40 min，每例手術(shù)中平均送檢1.7枚疑似甲狀旁腺組織。

圖1 疑似下甲狀腺旁腺組織無染色明視野鏡檢圖（×400） A：甲狀旁腺組織；B：脂肪組織；C：淋巴結(jié)組織；D：胸腺組織Figure 1 Images of bright-field microscopy without staining for suspected inferior parathyroid tissue (×400) A: Parathyroid tissue;B: Adipose tissue; C: Lymph node tissue; D: Thymus tissue

表1 196枚可疑下甲狀旁腺組織兩種檢測方法的檢測結(jié)果Table 1 The detection results of the 196 suspected parathyroid tissues by the two methods

2.2 術(shù)中無染色明視野鏡檢與術(shù)中冷凍病理結(jié)果比較

無染色明視野鏡檢判定各類組織的敏感性和特異性均較高，判定甲狀旁腺的敏感性為97.26%、特異性為100.00%，脂肪的敏感性為93.00%、特異性為97.63%，淋巴結(jié)的敏感性為88.00%、特異性為98.33%，胸腺的敏感性為83.00%、特異性為98.42%。兩種判定方法κ值均較高，即無染色明視野鏡檢法判定甲狀旁腺與術(shù)中冷凍病理判定甲狀旁腺具有非常強(qiáng)的一致性。無染色明視野鏡檢法與術(shù)中冷凍病理檢查判定各種類型組織的判定結(jié)果配對(duì)χ2檢驗(yàn)，兩種方法的判定結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）（表2）。

表2 無染色明視野鏡檢法與術(shù)中冷凍病理檢測方法的比較分析結(jié)果Table 2 Comparative analysis of bright-field microscopy without staining and intraoperative frozen pathological detection

2.3 術(shù)中術(shù)后甲狀旁腺功能比較

115例甲狀腺乳頭狀癌患者術(shù)前與術(shù)后1、30 d的iPTH及血清鈣平均值見表3。術(shù)后1、30 d的iPTH與血清鈣分別與術(shù)前的iPTH及血清鈣進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)。術(shù)后1 d與術(shù)前iPTH相比，iPTH下降有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），血清鈣下降無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；術(shù)前與術(shù)后30 d iPTH及血清鈣變化均無統(tǒng)計(jì)差異（均P＞0.05）。

表3 術(shù)前術(shù)后甲狀旁腺功能變化比較分析Table 3 Comparison of parathyroid function parameters before and after operation

3 討 論

甲狀腺癌手術(shù)中，原則上首先是盡最大可能清除病灶，其次是盡可能原位保留甲狀旁腺[5]。原位保留甲狀旁腺，避免和減少術(shù)后甲狀旁腺功能低下的發(fā)生的前提是術(shù)中準(zhǔn)確的辨認(rèn)甲狀旁腺[6]。精細(xì)的被膜解剖有利于甲狀旁腺辨識(shí)和原位保護(hù)，有效地辨認(rèn)甲狀旁腺和保護(hù)其血供是預(yù)防甲狀旁腺功能低下最有效手段[7-10]。精細(xì)解剖甲狀旁腺后，多數(shù)因血供在一定程度受損或者其供血血管受刺激后痙攣收縮而使其變?yōu)樽攸S至棕黑色，而脂肪組織和淋巴結(jié)一般不會(huì)變色，這時(shí)肉眼就可以辨認(rèn)出甲狀旁腺進(jìn)行原位保護(hù)[11]。上甲狀旁腺因解剖位置恒定，術(shù)中肉眼易辨識(shí)，但對(duì)于下甲狀旁腺因位置不固定，常常需與淋巴結(jié)、脂肪組織、胸腺組織相互鑒別，僅僅靠肉眼依據(jù)顏色和形狀來辨識(shí)存在困難。因此，下甲狀旁腺誤切幾率高。特別是甲狀腺癌手術(shù)中，為了保證淋巴結(jié)清掃的徹底性，甲狀旁腺誤切幾率大大增加，從而導(dǎo)致一過性甲狀旁腺功能減退，甚至的永久性甲狀旁腺功能減退發(fā)生率增加。術(shù)后甲狀旁腺功能減退的患者會(huì)出現(xiàn)面唇部或手足皮膚針刺樣感覺、麻木強(qiáng)直感、手足抽搐、呼吸困難、全身抽搐甚至昏迷等不同程度的低血清鈣癥狀，需要長期服用藥物改善癥狀，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。甲狀旁腺誤切的補(bǔ)救辦法是優(yōu)先選擇甲狀旁腺自體移植，甲狀旁腺自體移植能有效減少術(shù)后永久性甲狀旁腺功能減退的發(fā)生[12-13]，但前提是移植物必須確認(rèn)是誤切的甲狀旁腺組織。若將癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)誤判為甲狀旁腺組織行自體移植，最終導(dǎo)致腫瘤種植擴(kuò)散的嚴(yán)重后果。因此，提高術(shù)中甲狀旁腺的辨識(shí)率，避免或減少術(shù)后甲狀旁腺功能減退是甲狀腺外科醫(yī)師面臨的重要課題。

目前術(shù)中除肉眼辨認(rèn)外，術(shù)中判定甲狀旁腺的常用的方法包括靜脈注射亞甲藍(lán)甲狀旁腺正顯影、納米炭甲狀旁腺負(fù)顯影、術(shù)中光學(xué)相干層析成像系統(tǒng)識(shí)別技術(shù)、術(shù)中冷凍快速病理檢查等。早在1971年，Dudley等[14]報(bào)道術(shù)前靜脈注射亞甲藍(lán)用于甲狀旁腺正顯影判定甲狀旁腺。后來認(rèn)識(shí)到病理性甲狀旁腺組織易被亞甲藍(lán)染色[1,15]，而正常甲狀旁腺組織染色率很低，褪色較快[1,16]，亞甲藍(lán)還能使淋巴結(jié)染色[17]。亞甲藍(lán)雖然價(jià)格較為便宜，但其甲狀旁腺正顯影的敏感性較低，而且有神經(jīng)系統(tǒng)的毒副反應(yīng)[15]，目前甲狀腺癌手術(shù)中不推薦其用于正常甲狀旁腺的辨認(rèn)[1]。與其他示蹤劑相比，納米炭具有黑染率高、示蹤速度快、持續(xù)時(shí)間長、淋巴趨向性強(qiáng)的特點(diǎn)。因此在術(shù)中納米炭對(duì)甲狀腺及區(qū)域淋巴結(jié)均有高度識(shí)別示蹤作用[18]，可提高術(shù)中淋巴結(jié)及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)清掃數(shù)目[19-20]，更重要的是它能負(fù)顯影甲狀旁腺，利于甲狀旁腺的原位保護(hù)，降低術(shù)中甲狀旁腺損傷幾率和誤切率[21]。因此它是目前甲狀腺癌手術(shù)辨識(shí)甲狀旁腺較為理想的示蹤劑。但是術(shù)中注射納米炭需要掌握有一定的技巧，學(xué)習(xí)曲線較長，若注射不當(dāng)，導(dǎo)致無法辨認(rèn)甲狀旁腺；納米炭雖然沒有毒性的報(bào)道，但是在人體內(nèi)長期殘留，同時(shí)納米炭碳價(jià)格偏貴，不在醫(yī)保報(bào)銷范圍內(nèi)，臨床應(yīng)用大大受限。有學(xué)者[22-23]報(bào)道術(shù)中光學(xué)相干層析成像系統(tǒng)（OCT）可以不固定，染色，或組織切除用以術(shù)中判定頸部甲狀腺，脂肪，肌肉，淋巴結(jié)，甲狀旁腺組織準(zhǔn)確率達(dá)98.42%，但費(fèi)用昂貴。這些判定方法，因術(shù)者的經(jīng)驗(yàn)、患者的個(gè)體差異及經(jīng)濟(jì)效益的不同存在一定局限性，術(shù)中冷凍病理切片是誤切的甲狀旁腺自體移植前的確認(rèn)甲狀旁腺組織最常用的方法，它是術(shù)中確認(rèn)甲狀旁腺的金標(biāo)準(zhǔn)。本研究中就是以術(shù)中冷凍病理片為對(duì)照，探討無染色明視野鏡檢法辨認(rèn)甲狀旁腺的敏感性和特異性，是否具有替代術(shù)中冷凍病理確認(rèn)甲狀旁腺的潛力。

活體組織壓片后無染色明視野鏡檢法在甲狀腺癌術(shù)中辨認(rèn)甲狀旁腺國內(nèi)由1994年李泮泉等[24]報(bào)道。它的操作方法是：術(shù)中取可疑甲狀旁腺組織的1 mm3大小，用生理鹽水沖洗，放在載玻片上，以蓋玻片壓碎組織。立即行100倍顯微鏡下明視野鏡檢。該方法鏡檢甲狀旁腺組織的特點(diǎn)是：鏡下可見許多褐色小細(xì)胞密集團(tuán),可見體積較大透明脂肪細(xì)胞散在分布其中，部分脂肪細(xì)胞重疊。鏡下較容易與脂肪、淋巴結(jié)及胸腺組織區(qū)分開來。

本研究中采用無染色明視野鏡檢法采用400倍視野顯微鏡鏡下辨認(rèn)甲狀旁腺組織，鑒別要點(diǎn)主要是依據(jù)脂肪細(xì)胞的含量和小細(xì)胞的含量、密度、顏色、大小、分布特點(diǎn)不同來鑒定。需要區(qū)分的四種組織的共同特點(diǎn)是均含有脂肪細(xì)胞。脂肪組織和胸腺組織含有脂肪細(xì)胞最多，基本都是由脂肪細(xì)胞組成，脂肪組織和胸腺組織主要區(qū)別在于胸腺中脂肪細(xì)胞相對(duì)小些，而且小細(xì)胞集團(tuán)散在其中；淋巴組織含脂肪細(xì)胞次于脂肪和胸腺，脂肪細(xì)胞片狀分布其中；甲狀旁腺組織最少，脂肪細(xì)胞散在分布其中。甲狀旁腺組織可見特征性褐色小細(xì)胞密集團(tuán)，而淋巴結(jié)的小細(xì)胞密集團(tuán)較甲狀旁腺大，而且顏色是白色，很容易與淋巴組織鑒別。本研究顯示無染色明視野鏡檢法具有很高的敏感性（97.26%）和特異性（100%）。同樣該法辨認(rèn)脂肪，淋巴結(jié)及胸腺組織均有很高的敏感性和特異性。

本研究中以術(shù)中冷凍病理檢測為金標(biāo)準(zhǔn)，采用κ檢驗(yàn)測定無染色明視野鏡檢法與術(shù)中冷凍病理檢測這兩種方法判定各類組織的一致性，兩種方法判定甲狀旁腺、脂肪、淋巴結(jié)的各自一致性κ檢驗(yàn)κ均大于0.8，一致性非常強(qiáng)，僅判定胸腺的κ值在0.6到0.8之間，一致性仍好。因此，兩種判定方法一致性非常強(qiáng)。表明無染色明視野鏡檢法的準(zhǔn)確性很接近術(shù)中冷凍病理檢測，在很大程度可以替代術(shù)中冷凍病理用于判定甲狀旁腺。另外，本研究中采用配對(duì)χ2檢驗(yàn)測定兩種方法判定各類組織的判定結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），側(cè)面進(jìn)一步說明術(shù)中無染色明視野鏡檢法能較為準(zhǔn)確的鑒別甲狀旁腺、脂肪、淋巴結(jié)、胸腺組織，判定甲狀旁腺的可靠性接近術(shù)中冷凍病理檢測結(jié)果。比較術(shù)前術(shù)后術(shù)后iPTH及血清鈣水平發(fā)現(xiàn)，術(shù)后1 d與術(shù)前iPTH相比，iPTH下降有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），而血清鈣下降無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；術(shù)前與術(shù)后30 d iPTH及血清鈣變化均無統(tǒng)計(jì)差異（P＞0.05）。表明術(shù)后有一過性甲狀旁腺功能減退，術(shù)后1個(gè)月左右甲狀旁腺功能基本恢復(fù)到術(shù)前水平。通過對(duì)比術(shù)前術(shù)后甲狀腺功能的變化，進(jìn)一步說明本研究中無染色明視野鏡檢法在甲狀腺癌手術(shù)中判定甲狀旁腺可靠性高，利于甲狀旁腺的保護(hù)和功能的保留。

無染色明視野鏡檢法無需術(shù)中注射顯影劑，無毒副反應(yīng)，僅需要切?。? mm3疑似組織，切取的組織塊體積越小細(xì)胞越不容易重疊，也就越容易鑒別。而文獻(xiàn)[25-26]報(bào)道甲狀旁腺長5～7 mm，寬3～4 mm，厚2 mm，所以切?。? mm3對(duì)于原位保護(hù)或者自體移植后甲狀旁腺功能影響不大，因此認(rèn)為該方法安全性較好。相對(duì)術(shù)中冷凍病理檢測,它少了冷凍切片、快速染色以及固定等操作步驟，操作過程簡便，耗時(shí)短，平均耗費(fèi)時(shí)間約為4～5 min，比術(shù)中冷凍病理學(xué)檢查耗時(shí)縮短近25 min?？s短手術(shù)時(shí)間，相應(yīng)也降低了手術(shù)麻醉費(fèi)用。按照60 kg體質(zhì)量全麻麻醉維持費(fèi)800～1 000元/h的標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算，縮短25 min可降低約450元左右的麻醉費(fèi)用。對(duì)于誤切的甲狀旁腺組織，避免了較長時(shí)間的體外暴露，增加移植的成活率，降低甲狀旁腺功能低下的發(fā)生率。另外，無染色明視野鏡檢法病理檢測費(fèi)用也比術(shù)中冷凍病理低，因此，其時(shí)間經(jīng)濟(jì)效益優(yōu)勢(shì)明顯，符合衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)學(xué)原則，值得臨床應(yīng)用推廣。

綜上所述，甲狀腺癌手術(shù)中，無染色明視野鏡檢法辨認(rèn)甲狀旁腺的具有很高的敏感性和特異性，術(shù)中能準(zhǔn)確分辨出甲狀旁腺組織、脂肪組織、淋巴結(jié)組織、 胸腺組織。準(zhǔn)確性接近術(shù)中冷凍病理，從而減少甲狀旁腺誤切和錯(cuò)誤自體移植；同時(shí)具有操作簡便、耗時(shí)短，費(fèi)用低廉等優(yōu)點(diǎn)，很大程度上可替代術(shù)中冷凍病理判定甲狀旁腺，值得臨床應(yīng)用推廣。

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