羅國慶 周晶晶 李關杰 梁計煥 劉秋華 李思文 胡寧東 夏旭

乳腺癌是全球威脅女性健康的主要疾病之一，我國乳腺癌的發(fā)病率正逐年上升，并且呈年輕化的趨勢[1]。淋巴道轉(zhuǎn)移是決定乳腺癌預后最重要的因素之一[2]。研究表明許多腫瘤存在淋巴管新生，血管內(nèi)皮生長因子C （vascular endothelial growth factor C，VEGF-C） 是重要的促淋巴管生成因子[3]。VEGF-C可通過激活其特異性受體VEGFR-3促進腫瘤內(nèi)淋巴管的生成，進而促進淋巴轉(zhuǎn)移；有研究發(fā)現(xiàn)VEGF-C還有促進乳腺癌細胞遷移的功能，這些與腫瘤淋巴道播散轉(zhuǎn)移和預后密切相關[3、4]。因此，VEGF-C可以作為治療與預防乳腺癌淋巴道轉(zhuǎn)移的靶點，降低體內(nèi)VEGF-C的表達水平有可能抑制乳腺癌淋巴管新生與淋巴道轉(zhuǎn)移。RNAi技術的不斷成熟，為有效降低VEGF-C的表達提供了重要的理論依據(jù)與技術支持。

本研究使用針對人VEGF-C基因的RNAi片段，以慢病毒為載體，感染體外培養(yǎng)的人乳腺癌細胞MDA-MB-231，用Real-time PCR和Western blot方法檢測體外干擾后VEGF-C的表達水平變化；利用小室侵襲實驗檢測慢病毒感染后乳腺癌細胞侵襲能力的改變。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 細胞株 人乳腺癌細胞株MDA-MB-231，購自美國模式培養(yǎng)物保藏所（ATCC，USA）。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.1.2 siRNA慢病毒 購自上海吉凱基因化學技術有限公司；VEGF-C-siRNA序列為5'-CCTCAACT CAAGGACAGAA-3'，陰性對照siRNA序列為5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'。VEGF-C-siRNA慢病毒以及陰性對照siRNA慢病毒的滴度分別為5×108TU/ml、2×109TU/ml，均攜帶綠色熒光標記物。

1.1.3 主要試劑 含雙抗（青、鏈霉素）的細胞培養(yǎng)基RPMI-1640、胎牛血清、胰蛋白酶購自北京Solarbio生物科技有限公司。VEGF-C、GAPDH抗體購自Santa公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和dNTP購自Promega公司；Oligo dT購自上海生工；SYBR Master Mixture購自Takara公司；Cell Invasion Assay Kit購自Chemicon International。

1.1.4 主要儀器 OLYMPUS IX70倒置相差顯微鏡（光學工業(yè)株式會社），電泳用穩(wěn)壓電源、SDSPAGE 蛋白電泳儀、蛋白轉(zhuǎn)膜儀（上海天能），MCO-17AICO2溫箱（日本SANYO），5417R臺式冷凍高速離心機（Eppendorf公司），TDL-60B離心機（上海安亭科學儀器廠），恒溫水浴箱（山東環(huán)宇科研儀器廠），Real-time PCR儀器（Takara公司）。

1.2 方法

1.2.1 靶細胞慢病毒感染 目的細胞慢病毒感染實驗在6孔板中進行。細胞分成3組：未感染任何病毒的細胞組（CON組）、感染陰性對照病毒的細胞組（NC組）、感染RNAi靶點病毒的細胞組（KD組）。將細胞懸液（細胞數(shù)約為5×104）接種于6孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至細胞融合度約30%。根據(jù)病毒滴度值，KD組與NC組分別加入0.4μl、0.1μl的病毒。感染3d后觀察慢病毒上報告基因綠色熒光的表達情況，感染效率大于50%者繼續(xù)培養(yǎng)，感染7d后收集細胞抽提RNA進行Real-time PCR及Western blot檢測；感染效率低于50%者重新進行感染實驗。感染效率定義為同一視野感染細胞數(shù)占總細胞數(shù)的百分比。

1.2.2 Real-time PCR法檢測VEGF-C在靶細胞中的表達 根據(jù)Invitrogen公司的Trizol操作說明書進行RNA提取，之后根據(jù)M-MLV操作說明書（Promega公司）進行RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。引物序列為 Actin-F：5'-GGCGGCACCACCATGTACCCT-3'；Actin-R：5'-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3'；VEGFC-F：5'-AGGCTGGCAACATAACAGAGA-3'；VEGFC-R：5'-TCCCCACATCTATACACACCTC-3'。采用2-ΔΔCt法做相對定量分析。

1.2.3 Western blot法檢測VEGF-C在靶細胞中的表達 常規(guī)收獲細胞，超聲破碎儀破碎細胞，離心，取上清，BCA法測蛋白濃度，調(diào)整每個樣品蛋白終濃度為2 μg/μl。本實驗采用10%的分離膠，5%的濃縮膠，每個樣品取20 μg總蛋白量上樣。在4℃、400 mA恒流條件下電轉(zhuǎn)120min，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用封閉液（含5%脫脂牛奶的TBST溶液）室溫封閉PVDF膜4℃過夜。一抗孵育：用封閉液按1∶100、1∶5000分別稀釋 VEGF-C、GAPDH抗體，然后與封閉好的PVDF膜室溫孵育4℃過夜。二抗孵育：用封閉液按1∶5000稀釋相應的二抗，室溫下孵育PVDF膜2h。采用Amersham公司ECL+plusTM Western blotting system試劑盒進行顯色。

1.2.4 細胞侵襲實驗 用無血清培養(yǎng)基準備細胞懸液，每個嵌入物中侵襲室接種2.5×104個細胞每孔，培養(yǎng)48～72h，移去非侵襲細胞。將嵌入物浸泡在染色液中20min，在膜的下表面染色侵入細胞，顯微鏡拍照，10%醋酸溶解，OD570檢測。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以±s表示，采用方差分析，組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒載體感染效率 感染3d后在電子熒光顯微鏡下觀察每200倍鏡下的感染效率。經(jīng)觀察KD組與NC組感染效率均達到70%以上，CON組因為沒有轉(zhuǎn)染帶有綠色熒光標記的慢病毒，因此在電子熒光顯微鏡下不顯像，見圖1～6?？梢娐《居休^高的感染效率。

圖1 KD組白光顯像（×200）

圖2 NC組白光顯像（×200）

圖3 CON組白光顯像（×200）

圖4 KD組熒光顯像（×200）

圖5 NC組熒光顯像（×200）

圖6 CON組熒光顯像（×200）

2.2 VEGF-C mRNA在目的細胞中的表達 通過Real-time PCR檢測慢病毒感染7d后各組VEGF-C的表達情況。各組組間差異有統(tǒng)計學意義（F=5.14，P<0.05）。NC組與CON組表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；KD組較 CON組及 NC組表達明顯下調(diào)，沉默效率大于60%，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表1。結(jié)果表明VEGF-C-siRNA能有效抑制VEGF-C mRNA的表達，陰性對照siRNA對VEGF-C的表達無影響。

表1 各組VEGF-C mRNA的表達水平

2.3 VEGF-C蛋白在目的細胞中的表達 慢病毒感染7d后按組抽提蛋白進行蛋白印跡實驗，結(jié)果顯示：與CON組及NC組相比，KD組GAPDH條帶亮度幾乎無差異，而KD組細胞靶基因蛋白表達明顯減少，CON組與NC組無明顯差異。 實驗結(jié)果進一步證實了VEGF-C-siRNA在蛋白水平對靶基因的抑制及其作用的特異性。各組VEGF-C蛋白印跡實驗結(jié)果見圖7。

圖7 各組VEGF-C蛋白表達

2.4 VEGF-C-siRNA對腫瘤細胞侵襲性的影響 通過細胞侵襲實驗檢查感染3d后VEGF-C-siRNA和陰性對照siRNA對腫瘤細胞侵襲性的影響。在顯微鏡下觀察，染色后KD組顏色較NC組、CON組明顯變淡，見圖8～13。10%醋酸溶解，檢測KD組、NC組、CON組OD570的吸光值分別為0.181±0.001、0.247±0.005、0.254±0.003，組間差異明顯，有統(tǒng)計學意義（F=603.34，P<0.05）；與 NC組、CON組相比，VEGF-C-siRNA明顯抑制腫瘤細胞的侵襲能力（P<0.05）；NC組與CON組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

圖8 KD組染色前顯像（×400）

圖9 NC組染色前顯像（×400）

圖10 CON組染色前顯像（×400）

圖11 KD組染色后顯像（×400）

圖12 NC組染色后顯像（×400）

圖13 CON組染色后顯像（×400）

3 討論

淋巴道轉(zhuǎn)移是乳腺癌最常見的轉(zhuǎn)移途徑之一，通過淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移情況可以協(xié)助乳腺癌分期和選擇治療方案[5]。淋巴管新生為腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移提供了重要的途徑。一系列關于淋巴管生成的分子機制和淋巴內(nèi)皮細胞特異性標記物的研究提示：在正常生物體和腫瘤的淋巴管生成中VEGF家族的成員 VEGF-C起著關鍵作用，其促進淋巴管新生的作用通過與特異性受體VEGFR-3結(jié)合產(chǎn)生。乳腺癌中的VEGF-C過表達明顯提高瘤內(nèi)淋巴管生成因子的水平，而且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移嚴重程度呈正相關[6]。對比VEGF-C表達陰性的乳腺癌患者，VEGF-C表達陽性的患者 5 年生存率低（P=0.035），因此VEGF-C有可能成為預測乳腺癌復發(fā)的標記物[7]。既往研究顯示，VEGF-C產(chǎn)生于癌細胞及基質(zhì)細胞，通過自分泌和旁分泌發(fā)揮作用，它誘導淋巴管新生及介導癌細胞淋巴道轉(zhuǎn)移的作用與其產(chǎn)生的量密切相關[8、9]。由此可見，抑制或者敲除VEGF-C的表達對預防與抑制乳腺癌的淋巴道轉(zhuǎn)移具有非常重要的作用。

使用病毒載體可以提高質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染效果穩(wěn)定且可轉(zhuǎn)染的細胞范圍廣泛，從而擴大RNAi應用范圍，因此病毒載體介導RNAi近年來受到重點關注[10，11]。本研究使用慢病毒作為載體，感染7d后采用實時定量PCR檢查，VEGF-C-siRNA對VEGF-C的沉默效果明顯，沉默效率大于60%，與陰性對照組以及空白對照組之間的表達差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。慢病毒感染7d后按組抽提蛋白進行蛋白印跡實驗，從蛋白水平再次驗證了VEGF-C-siRNA能穩(wěn)定有效抑制VEGF-C的表達。小室侵襲實驗結(jié)果顯示：對比陰性對照組及空白對照組，在慢病毒感染3d后，VEGF-C-siRNA可降低腫瘤細胞的侵襲能力（P<0.05）。

綜上所述，使用siRNA技術以慢病毒為載體，可有效抑制人乳腺癌細胞MDA-MB-231 VEGF-C的表達，并能降低細胞的侵襲能力，為體外基因預防與治療乳腺癌淋巴道轉(zhuǎn)移提供了實驗依據(jù)，并為后續(xù)進行動物實驗以及體內(nèi)實驗奠定了重要基礎。

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