王孝德，李志賢，黃 覺(jué)，黃詩(shī)惠，禹婷婷

(1.賀州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西賀州 542800；2.賀州市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，廣西賀州 542800)

豬O型口蹄疫是嚴(yán)重危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的疫病,是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)規(guī)定必須報(bào)告的傳染病之一，我國(guó)規(guī)定為一類(lèi)動(dòng)物疫病[1-2]。目前，國(guó)內(nèi)外預(yù)防和控制該病的主要措施是給易感動(dòng)物接種疫苗，在我國(guó)屬于強(qiáng)制免疫病種[3-4]。由于O型口蹄疫流行毒株在不斷的變化中，從2010年開(kāi)始，O型口蹄疫的流行以O(shè)/MYA98/BY/2010毒株為主，在韓國(guó)、越南、日本等地先后報(bào)道出現(xiàn)過(guò)疫情[5-6]。目前我國(guó)豬口蹄疫的強(qiáng)制免疫選用的疫苗毒株以豬口蹄疫O型滅活疫苗(O/MYA98/BY/2010株)為主，但在生產(chǎn)實(shí)踐中由于受多種因素的影響，一些接種過(guò)疫苗的易感動(dòng)物不能達(dá)到預(yù)期的免疫效果，免疫失敗也時(shí)有發(fā)生，甚至可能發(fā)生疫情[7-9]。因此，通過(guò)對(duì)免疫后的豬進(jìn)行抗體水平檢測(cè)，分析評(píng)估免疫效果，切實(shí)掌握本地生豬O型口蹄疫免疫情況，為更好制定合理的免疫程序提供科學(xué)依據(jù)，確保不發(fā)生區(qū)域性豬O型口蹄疫疫情有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 疫苗與試驗(yàn)用豬 豬口蹄疫O型滅活疫苗(O/MYA98/BY/2010株)，中農(nóng)威特生物科技股份有限公司生產(chǎn)，政府采購(gòu)苗，批號(hào)為H160307J，由賀州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心供應(yīng)。選擇品種一致，在35日齡～38日齡、體重相近，臨床觀察1周后確認(rèn)健康，經(jīng)檢測(cè)O型口蹄疫母源抗體在5log2以下(表1)，未經(jīng)免疫口蹄疫O型滅活疫苗的健康仔豬150頭。

1.1.2 免疫劑量與診斷液 按照說(shuō)明書(shū)要求每頭每次肌肉注射2 mL。本次試驗(yàn)務(wù)必要求操作規(guī)范，無(wú)失誤。操作時(shí)由助手保定豬，然后注射者抓住豬耳，根據(jù)豬的大小在豬耳根后2 cm～5 cm處垂直入針注射?？谔阋逴型液相阻斷ELISA試劑盒，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所生產(chǎn)，批號(hào) 20160830101-8。

1.1.3 主要儀器 酶標(biāo)儀由帝肯上海貿(mào)易有限公司生產(chǎn)；單道移液器、多道移液器均由德國(guó)Tranferspette公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 免疫分組和方法 在某一規(guī)模豬場(chǎng)(存欄母豬在100頭以上)選擇90頭35日齡～38日齡的試驗(yàn)豬隨機(jī)分成A、D、G 3組，每組30頭；另一規(guī)模豬場(chǎng)(存欄母豬50頭)選擇30頭35日齡～38日齡的試驗(yàn)豬隨機(jī)分成B、E、H 3組，每組10頭；某村選擇5戶(hù)散養(yǎng)戶(hù)，選擇35日齡～38日齡的豬各6頭，共30頭試驗(yàn)豬分成C、F、I 3組(3組中每戶(hù)2頭)，每組10頭。標(biāo)記飼養(yǎng)。

A、B、C 3組為1次免疫組，即在35日齡～38日齡注射2 mL豬口蹄疫O型滅活疫苗進(jìn)行第1次免疫接種。D、E、H 3組為2次免疫組，即在第1次免疫后間隔28 d，進(jìn)行2次免疫，免疫劑量和方法同第1次免疫。C、F、I 3組為3次免疫組，即在第2次免疫后間隔28 d，進(jìn)行第3次免疫，免疫劑量和方法同第1次免疫。

1.2.2 采血日齡 A、B、C 3組分別于第1次免疫后的28、56、84 d前腔靜脈采血，收集血清，存于-20℃?zhèn)錂z。D、E、H 3組在第1次免疫后28 d前腔靜脈采血采血，收集血清，存于-20℃?zhèn)錂z。當(dāng)天進(jìn)行第2次免疫,在距第1次免疫后的56 d、84 d分別前腔靜脈采血，收集血清，存于-20℃?zhèn)錂z。C、F、I 3組在第1次免疫后28 d前腔靜脈采血，收集血清，存于-20℃?zhèn)錂z；當(dāng)天進(jìn)行第2次免疫，距第1次免疫后56 d前腔靜脈采血，當(dāng)天進(jìn)行第3次免疫，距第1次免疫后84 d前腔靜脈采血。收集血清，存于-20℃?zhèn)錂z。

1.2.3 檢測(cè)方法與結(jié)果判定 采用液相阻斷ELISA方法檢測(cè)，每塊板檢測(cè)按10頭份設(shè)計(jì)，具體操作參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。判定標(biāo)準(zhǔn)為：當(dāng)抗體效價(jià)≥6log2，被檢血清的免疫抗體為合格；抗體效價(jià)<6log2，被檢血清的免疫抗體為不合格。

2 結(jié)果

試驗(yàn)豬均未觀察到有食欲減退、跛行等不良反應(yīng)。第1次免疫后免疫抗體產(chǎn)生情況(表2)和不同免疫次數(shù)仔豬產(chǎn)生的口蹄疫抗體效價(jià)及合格率(表3)表明，第1次免疫后28 d檢測(cè)，免疫抗體效價(jià)較低，免疫抗體總合格率僅為12.7%，規(guī)模養(yǎng)豬場(chǎng)為13.3%，略高于農(nóng)村散養(yǎng)戶(hù)的10%；距離第1次免疫后56 d和84 d檢測(cè)，免疫抗體效價(jià)較低，免疫抗體總合格率為26%，規(guī)模養(yǎng)豬場(chǎng)為30%，略高于農(nóng)村散養(yǎng)戶(hù)的10%。

表1 免疫前試驗(yàn)仔豬母源抗體檢測(cè)情況

表2 1次免疫免疫抗體檢測(cè)情況

第2次免疫后免疫抗體產(chǎn)生情況(表4)和不同免疫次數(shù)仔豬產(chǎn)生的口蹄疫抗體效價(jià)及合格率(表3)表明，經(jīng)過(guò)第2次免疫接種豬口蹄疫O型滅活疫苗后，距離第1次免疫后56 d檢測(cè)，免疫抗體總合格率達(dá)45%，規(guī)模養(yǎng)豬場(chǎng)為47.5%，略高于農(nóng)村散養(yǎng)戶(hù)的35%；距離第1次免疫后84 d檢測(cè)，免疫抗體總合格率達(dá)56%，規(guī)模養(yǎng)豬場(chǎng)為57.5%，略高于農(nóng)村散養(yǎng)戶(hù)的50%。

第3次免疫后免疫抗體產(chǎn)生情況(表5)和不同免疫次數(shù)仔豬產(chǎn)生的口蹄疫抗體效價(jià)及合格率(表3)表明，經(jīng)過(guò)3次免疫接種豬口蹄疫O型滅活疫苗后，距離第1次免疫后84 d檢測(cè)，免疫抗體合格率達(dá)98%，規(guī)模場(chǎng)和散養(yǎng)戶(hù)免疫抗體總合格率都達(dá)90%以上。

3 討論

3.1 母源抗體效價(jià)的高低對(duì)仔豬免疫后免疫抗體的產(chǎn)生有影響

未免疫豬口蹄疫O型滅活疫苗的斷奶仔豬體內(nèi)O型口蹄疫抗體效價(jià)與母豬的免疫情況有關(guān)，在母豬配種前，加強(qiáng)免疫豬口蹄疫O型滅活疫苗的斷奶仔豬免疫抗體合格率高、持速時(shí)間長(zhǎng)，到49日齡時(shí)，免疫抗體合格率依然可達(dá)80%[10-11]。因此，本試驗(yàn)通過(guò)母源抗體效價(jià)檢測(cè)，選用母源抗體效價(jià)都在5log2以下的試驗(yàn)仔豬。根據(jù)當(dāng)?shù)貙?shí)際情況，母豬的免疫一般都是間隔4個(gè)多月補(bǔ)針，多數(shù)未在母豬懷孕前加強(qiáng)免疫。因此，本試驗(yàn)結(jié)果在指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐中更具有指導(dǎo)作用，更接近當(dāng)?shù)氐膶?shí)際情況。

表3 不同免疫次數(shù)仔豬的口蹄疫抗體水平及合格率

表4 2次免疫免疫抗體檢測(cè)情況

表5 3次免疫免疫抗體檢測(cè)情況

3.2 同樣的免疫程序，豬口蹄疫O型滅活疫苗(O/MYA98/BY/2010株)與豬口蹄疫O型滅活疫苗(OZK/93株)不同

按薛新梅等[12]報(bào)道的口蹄疫母源抗體對(duì)仔豬疫苗免疫的影響看：二次免疫豬口蹄疫O型滅活疫苗(OZK/93株)后一個(gè)月，檢測(cè)到的免疫抗體合格率達(dá)85%，平均抗體效價(jià)在7.65log2，與我們?cè)?010年至2011年上半年期間(使用OZK / 93 株)的滅活疫苗)檢測(cè)到的免疫抗體合格率84.17%基本相合；2011年下半年開(kāi)始使用豬口蹄疫O型滅活疫苗(O/MYA98/BY/2010株)后，在2011年下半年至2012年日常監(jiān)測(cè)到的二次免疫豬口蹄疫O型滅活疫苗(O/MYA98/BY/2010株)的斷奶仔豬免疫抗體合格率43.67%，抗體滴度不高，離散度較大。本次試驗(yàn)在2次免疫后28 d時(shí)，檢測(cè)結(jié)果顯示免疫抗體合格率在45%，2次免疫后56 d時(shí)，檢測(cè)結(jié)果顯示免疫抗體合格率達(dá)56%，仍達(dá)不到農(nóng)業(yè)部要求的免疫抗體合格率達(dá)70%以上的要求。說(shuō)明豬口蹄疫O型(O/MYA98/BY/2010株)毒株比以前口蹄疫O型毒株(如OZK/93株)更能降低豬對(duì)這種毒株的應(yīng)答能力，對(duì)豬的危害性就更大。

3.3 3次免疫后免疫抗體合格率較高

3次免疫后28 d時(shí)，檢測(cè)結(jié)果顯示免疫抗體合格率達(dá)98%，且免疫抗體滴度保持較高狀態(tài)，抗體效價(jià)達(dá)到9 log2，超過(guò)農(nóng)業(yè)部要求的免疫抗體合格率達(dá)70%以上的要求。且3次免疫后抗體滴度標(biāo)準(zhǔn)差為1.05 log2，變異系數(shù)為13.125%，表明群體抗體均衡度高、離散度低，則疫苗的免疫效果就好。

本次試驗(yàn)包括大型養(yǎng)豬場(chǎng)、中小養(yǎng)殖場(chǎng)和散養(yǎng)戶(hù)，試驗(yàn)結(jié)果表明，大型養(yǎng)豬場(chǎng)由于科學(xué)養(yǎng)殖水平高，比中小養(yǎng)豬場(chǎng)的免疫情況要好，但差距不是非常明顯，農(nóng)村散養(yǎng)戶(hù)的免疫抗體合格率與大型養(yǎng)豬場(chǎng)和中小養(yǎng)豬場(chǎng)的100%免疫抗體合格率相比差距較小，3次免疫后免疫抗體合格率達(dá)90%，說(shuō)明3次免疫后，規(guī)范操作，不論是大型養(yǎng)豬場(chǎng)、中小養(yǎng)殖場(chǎng)還是散養(yǎng)戶(hù)，豬口蹄疫O型(O/MYA98/BY/2010株)滅活苗的免疫抗體合格率都能達(dá)到農(nóng)業(yè)部要求的70%以上。

豬口蹄疫O型(O/MYA98/BY/2010株)毒株毒力強(qiáng)，1次、2次免疫后，豬產(chǎn)生的免疫抗體滴度不高、免疫抗體合格率未能達(dá)到農(nóng)業(yè)部要求的70%以上，3次免疫后，免疫抗體合格率可達(dá)到80%以上，免疫抗體滴度整齊、離散度低，達(dá)到國(guó)家要求，若能進(jìn)行3次免疫，免疫效果將更好，在規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)應(yīng)大力提倡。由于當(dāng)前養(yǎng)豬業(yè)，要免疫豬瘟、高致病性豬藍(lán)耳病、豬偽狂犬病、豬圓環(huán)病毒等疫苗，本試驗(yàn)是在不影響其他病種免疫的情況下進(jìn)行。因此，對(duì)豬口蹄疫O型(O/MYA98/BY/2010株)滅活苗的免疫效果或有影響，但更接近生豬生產(chǎn)的實(shí)際情況，對(duì)一些不具備檢測(cè)口蹄疫O型免疫抗體的養(yǎng)殖戶(hù)制定豬O型口蹄疫(O/MYA98/BY/2010株)的免疫程序具有重要的指導(dǎo)作用。

參考文獻(xiàn)：

[1] 羅 燕.用酶聯(lián)免疫吸附法對(duì)豬O型口蹄疫免疫抗體檢測(cè)及分析[J].四川農(nóng)業(yè)科技,2016(11):49-51.

[2] Fernandez-Sainz I,Medina GN,Ramirez-Medina E,et al.Adenovirus-vectored foot-and-mouth disease vaccine confers early and full protection against FMDV O1 Manisa in swine [J].Virology,2017(502):123-132.

[3] 陳方志,邱伯根,劉道新,等.豬口蹄疫O型合成肽疫苗抗體水平檢測(cè)[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2009(8):116-118.

[4] 趙 力,張智鵬,韋選民,等.兩種O型口蹄疫滅活疫苗免疫豬抗體消長(zhǎng)規(guī)律比較[J].中國(guó)豬業(yè),2016(9):72-74.

[5] 江 東,周 兵,許志成,等豬口蹄疫O型疫苗免疫效果監(jiān)測(cè)分析[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志,2011,47(8):38-40.

[6] 李煥斌,熊愛(ài)輝.豬口蹄疫O型滅活疫苗制苗毒株的篩選[J].中國(guó)畜禽種業(yè),2016(8):132-134.

[7] Sharma G K,Mahajan S,Matura R,et al.Quantitative single dilution liquid phase blocking ELISA for sero-monitoring of foot-and-mouth disease in India [J].Biologicals,2015,(3):158-164.

[8] 姚懷兵,趙 毅,劉夢(mèng)麗,等.口蹄疫病毒3C蛋白酶結(jié)構(gòu)與功能及應(yīng)用研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2017(3):102-106.

[9] 徐正軍,程 雷,徐小艷,等.江蘇省部分種豬場(chǎng)O型口蹄疫免疫效果監(jiān)測(cè)[J].中國(guó)動(dòng)物檢疫,2008(7):40-41.

[10] Sharma G K,Mahajan S,Matura R,et al.Herd immunity against foot-and-mouth disease under different vaccination practices in india [J].Transb Emerg Dis,2016,(26):10-11.

[11] 胡 杰,張步嫻,屈素潔,等.不同免疫方式對(duì)仔豬高致病性豬繁殖與呼吸綜合癥、豬瘟、豬口蹄疫三種抗體水平的影響[J].中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào),2014,22(5):61-67.

[12] 薛新梅,魯夢(mèng)婷,薛 琴.口蹄疫母源抗體對(duì)仔豬疫苗免疫的影響[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志,2014,50(8):56-58.