馬 昭，羅 燕，劉 鋼，楊 莉，劉曉婷，朱曉慶，谷新利

(石河子大學動物科技學院，新疆石河子 832003)

從20世紀30年代人們發(fā)現(xiàn)多糖的抗腫瘤活性后，科研工作者對中藥多糖產(chǎn)生了濃厚的興趣，發(fā)現(xiàn)了多種具有生物活性的中藥多糖。免疫調(diào)節(jié)作用是中藥多糖的生物活性之一，大量的藥理試驗也證實中藥多糖能通過激活淋巴細胞，使淋巴細胞處于活化狀態(tài)，誘導細胞形態(tài)、功能和表型發(fā)生變化，分泌細胞因子等方式增強機體免疫力。并且，中藥多糖具有療效持久，毒性和不良反應(yīng)少等諸多優(yōu)點[1]。

主要組織相容性復合體(majior histocompatibility complex，MHC)是與免疫應(yīng)答和抗病性密切相關(guān)的一組基因群，它編碼細胞表面的特異性蛋白。MHC作為細胞表面的糖蛋白，在細胞免疫和體液免疫中發(fā)揮著重要作用。MHC抗原基因具有高度的多態(tài)性，不僅決定了所表達抗原分子的多態(tài)性，而且決定了生物學功能的多樣性。由于MHC基因的多態(tài)性導致不同個體間對疾病抗性和易感性存在差異[2-3]。王世波等[4]研究了魯禽雞、瑯琊雞和石歧雞B-F exon2的多態(tài)性以及SNP位點與綿羊紅細胞(SRBC)免疫抗體滴度和新城疫(ND)及禽流感(AI)的免疫抗體滴度的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)AI、ND以及SRBC抗原抗體的產(chǎn)生與B-F exon2的多態(tài)性有較強的相關(guān)性。周偉等[5]研究了狼山雞MHC多態(tài)性及血型與部分抗性性狀相關(guān)性，結(jié)果提示免疫性狀和血型之間有關(guān)聯(lián)性。

基于以上研究基礎(chǔ)，本試驗采用PCR-SSCP和實時熒光定量PCR real-time PCR方法，檢測中藥復方多糖(compound Chinese herbal medicinal polysaccharides，cCHMPS)對不同MHC B-Lβ Ⅱ基因型雞淋巴細胞中IL-1β、TNF-α和IL-8 mRNA表達量的影響，探討MHC B-Lβ Ⅱ基因多態(tài)性對中藥復方多糖提高雞淋巴細胞中細胞因子mRNA表達量的最佳使用劑量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗藥物 中藥復方多糖由黨參、山楂、熟地、何首烏、當歸、茯苓、補骨脂等11味中藥組成，各單味藥均購自石河子市醫(yī)藥公司；中藥復方多糖粗提取物是從中藥復方中采用水提-醇沉法提取，再經(jīng)AB-8大孔吸附樹脂吸附解吸附后獲得精制的中藥復方多糖，即cCHMPS，其含糖量為77.10%；用不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)液將其配置成200、150、100 μg/mL的cCHMPS，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過后4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑與儀器 雞外周血淋巴細胞分離液，天津市灝洋生物制品科技有限責任公司產(chǎn)品；RPMI 1640培養(yǎng)基，PBS磷酸緩沖液，胎牛血清，SYBR Green熒光染料，real-time PCR試劑，全式金公司產(chǎn)品；DEPC，上海生物工程公司產(chǎn)品；雞新城疫疫苗(La Sota株)，普萊柯生物工程股份有限公司產(chǎn)品；RNA、DNA提取試劑盒，膠回收試劑盒，RNAprep Pure Cell/Bacteria k-it，北京田根生物工程公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機，垂直離心機，新疆農(nóng)墾科學院實驗室。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 500羽1日齡京紅1號蛋雞，購自新疆昌吉某孵化場。翅下靜脈采血0.2 mL/羽，置于肝素鈉抗凝采血管中搖勻，置-20℃冷凍保存。按照DNA提取試劑盒說明書提取雞全血DNA，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank中收錄的雞MHC B-LβⅡ基因序列(№M29763.1)，應(yīng)用Oligo軟件設(shè)計引物，引物序列為：上游引物：5′-AAACCGACCGTCTGGCGTGCTA-3′，下游引物：5′-TTACCCCACGCCTGGCTGAT-3′，擴增片段238 bp，引物由華大基因科技股份有限公司合成。

1.2.3 PCR擴增 PCR擴增體系為20 μL：10 μL 的2×RCRMix，2 μL模板DNA，上、下游引物各0.5 μL，7 μL ddH2O，總體積為20 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃ 5 min；94℃ 40 s，60.5℃ 45 s，72℃ 35 s，共35個循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃結(jié)束反應(yīng)。取5 mL PCR擴增產(chǎn)物由20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

1.2.4 淋巴細胞的分離與成活率檢測 根據(jù)PCR-SSCP基因型對雞分組，參照文獻[6]靜脈采血提取淋巴細胞，胎盤藍染色，顯微鏡下數(shù)死細胞和活細胞個數(shù)，計算活細胞成活率。

1.2.5 試驗分組與細胞培養(yǎng) 將分離得到的淋巴細胞濃度調(diào)整為5×106個/mL。將雞淋巴細胞按不同基因型分組，每組設(shè)置3個劑量組，調(diào)整cCHMPS的終濃度分別為100、75、50、0 μg/mL，接于6孔培養(yǎng)板中，37℃、體積分數(shù)為5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后收集細胞。

1.2.6 雞淋巴細胞總RNA提取 收集淋巴細胞，按照RNA提取試劑盒說明書提取淋巴細胞的總RNA。RNA純度檢測：檢測其OD260nm/OD280nm比值，其比值在1.8～2.0之間。

1.2.7 RNA反轉(zhuǎn)錄 將2 μL 5×gDNA Graser buffer、1 μL gDNA eraser、5 μL RNase free water、2 μL RNA模板混勻，42℃反應(yīng)2 min，迅速冰浴，即反應(yīng)液Ⅰ，最后將1 μL Prime Scriptrt MIXⅠ、1 μL RT Primer MIX、4 μL 5×Primscript buffer、4 μL RNase free water加入反應(yīng)液Ⅰ中，37℃反應(yīng)15 min，85℃加熱5 s使反轉(zhuǎn)錄酶失活，取出EP管，置-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.8 cDNA的PCR反應(yīng)體系與程序 根據(jù)GenBank公布的IL-1β、TNF-α、IL-8及β-Actin基因mRNA的全長序列設(shè)計RCR特異性引物，并由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列見表1。

表1 目的基因引物序列及PCR條件

cDNA的PCR反應(yīng)體系：1 μL cDNA模板，上游引物和下游引物各0.5 μL，8 μL ddH2O，10 μL的2×RCRMix， 總體積為20 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，退火30 s，72℃ 30 s，共35個循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃結(jié)束反應(yīng)。

1.2.9 實時熒光定量PCR real-time PCR反應(yīng)體系：2×TransStart?Tip Green qPCR SuperMIX 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，1 μL cDNA，8 μL ddH2O，20 μL體系。反應(yīng)程序為：94℃ 30 s；94℃ 5 s；退火15 s，72℃ 10 s，共42個循環(huán)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 MHC B-LβⅡ基因PCR擴增結(jié)果

用所設(shè)計的引物對基因組DNA進行擴增，取所得PCR產(chǎn)物5 μL于瓊脂糖凝膠上進行電泳(圖1)。所設(shè)計引物的擴增結(jié)果較好，片段長度與預期大小一致，條帶清晰，無非特異性條帶，可直接進行SSCP分析。

1.DNA 標準DL 1 000； 2～11.MHC B-LβⅡ基因1.DNA Maker DL 1 000；2-11.MHC B-LβⅡ gene

2.2 PCR-SSCP分析

對所有DNA樣本的PCR產(chǎn)物進行SSCP多態(tài)性檢測，發(fā)現(xiàn)所擴增片段有3種基因型，分別定義為AA(103羽)、BB(266羽)和BC(131羽)(圖2)。

1、6、8、10、12.BC基因型；3、5.AA基因型；2、4、7、9、11、13.BB基因型

1，6，8，10，12.BC genotype; 3，5.AA genotype; 2，4，7，9，11，13.BB genotype

圖2部分雞MHC B-Lβ Ⅱ基因PCR-SSCP電泳圖譜

Fig.2 Electrophoretic patterns of PCR-SSCP products of MHC B-LβⅡ gene

2.3 IL-1β、TNF-α、IL-8及β-Actin擴增結(jié)果

用所設(shè)計的雞IL-1β、TNF-α、IL-8及β-Actin基因的引物，以cDNA為模板進行PCR擴增，經(jīng) 20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，分別獲得了145 bp、80 bp、229 bp的目的條帶(圖3)。

1.IL-1β基因; 2.IL-8基因; 3.TNF-α基因; 4.基因β-Actin; 5.DNA 標準

1.IL-1β gene; 2.IL-8 gene;3.TNF-α gene; 4.β-Actin gene; 5.DNA Maker

圖3 IL-1β、TNF-α、IL-8及β-Actin基因PCR產(chǎn)物電泳圖

Fig.3 Electrophoretic patterns of PCR products of IL-1β,TNF-α,IL-8 and β-Actin genes

2.4 中藥復方多糖對不同MHC B-LβⅡ基因型雞外周血淋巴細胞中IL-1β mRNA表達量的影響

由表2可知，與對照組相比，cCHMPS能顯著促進雞淋巴細胞IL-1β mRNA的表達，且在不同基因型雞中，最有效的提高IL-1β mRNA表達量所需的cCHMPS劑量不同。AA基因型雞中，cCHMPS劑量為75 μg/mL和50 μg/mL時，雞淋巴細胞IL-1β mRNA表達量顯著高于其他劑量組(P<0.05)；BB基因型雞中，cCHMPS劑量為100 μg/mL時，雞淋巴細胞IL-1β mRNA表達量均顯著高于其他劑量組(P<0.05)；BC基因型雞中，cCHMPS劑量為50 μg/mL時，IL-1β mRNA表達量均顯著高于其他劑量組(P<0.05)。

2.5 中藥復方多糖對不同MHC B-LβⅡ基因型雞外周血淋巴細胞中TNF-α mRNA表達量的影響

由表3可知，與對照組相比，cCHMPS能顯著促進雞淋巴細胞TNF-α mRNA的表達，且在不同基因型雞中，最有效的提高TNF-α mRNA表達量所需的cCHMPS劑量不同。AA基因型雞中，cCHMPS劑量為75μg/mL和50 μg/mL時，雞淋巴細胞TNF-α mRNA表達量顯著高于其他劑量組(P<0.05)；BB基因型雞中，cCHMPS劑量為100 μg/mL時雞淋巴細胞TNF-α mRNA表達量均顯著高于其他劑量組(P<0.05)；BC基因型雞中，cCHMPS劑量為50 μg/mL時，TNF-α mRNA表達量均顯著高于其他劑量組(P<0.05)。

2.6 中藥復方多糖對不同MHC B-LβⅡ基因型雞外周血淋巴細胞中IL-8 mRNA表達量的影響

由表4可知，與對照組相比，cCHMPS能顯著促進雞淋巴細胞IL-8 mRNA的表達，且在不同基因型雞中，最有效的提高IL-8 mRNA表達量所需的cCHMPS劑量不同。AA基因型雞中，cCHMPS劑量為75μg/mL和50 μg/mL時，雞淋巴細胞IL-8 mRNA表達量顯著高于其他劑量組(P<0.05)；BB基因型雞中，cCHMPS劑量為100 μg/mL時雞淋巴細胞IL-8 mRNA表達量均顯著高于其他劑量組(P<0.05)；BC基因型雞中，cCHMPS劑量為50 μg/mL時，IL-8 mRNA表達量均顯著高于其他劑量組(P<0.05)。

表2 中藥復方多糖對各基因型雞淋巴細胞IL-1β mRNA表達量的影響

注：同行小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)，*表示與對照組比較差異顯著(P<0.05)。

Note:In the same row,different letters mean significant difference(P<0.05).*means significant difference compared with control group.

表3 中藥復方多糖對各基因型雞淋巴細胞TNF-α mRNA表達量的影響

注：同行小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)，*表示與對照組比較差異顯著(P<0.05)。

Note:In the same row,different letters mean significant difference(P<0.05).*means significant difference compared with control group.

表4 中藥復方多糖對各基因型雞淋巴細胞IL-8 mRNA表達量的影響

注：同行小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)，*表示與對照組比較差異顯著(P<0.05)。

Note:In the same row,different letters mean significant difference(P<0.05).*means significant difference compared with control group.

3 討論

3.1 中藥復方多糖對雞淋巴細胞IL-1β、TNF-α、IL-8 mRNA表達量的影響

淋巴細胞是參與機體免疫應(yīng)答的主要免疫效應(yīng)細胞[7]。淋巴細胞分泌的細胞因子是一類具有免疫調(diào)節(jié)功能的蛋白質(zhì)類物質(zhì)，是免疫系統(tǒng)重要的免疫信號分子[8]。研究細胞因子有助于了解機體的免疫調(diào)節(jié)機制。IL-1β、TNF-α、IL-8等炎癥細胞因子在免疫應(yīng)答中充當著十分重要的角色。其中，IL-1β是IL-1的主要亞型之一，具有高度生物活性，可以誘導淋巴細胞的增殖分化，刺激抗體產(chǎn)生，調(diào)節(jié)免疫作用等[9]，也能刺激產(chǎn)生IL-8、中性粒細胞活化劑等多種趨化因子，以及誘導單核細胞和巨噬細胞釋放IL-6、TNF[10]。IL-8是一種趨化性細胞因子，由Th1細胞分泌的細胞因子，使趨化細胞到達炎癥部位，激活炎性細胞，誘導細胞增殖，釋放炎性介質(zhì)，具有抗炎的作用[11]。TNF-α是由Th1細胞分泌，它作為活化的單核細胞產(chǎn)生的一種具有多種生物學功能的細胞因子在炎癥和感染機制中起著介導作用[12]。TNF-α可殺傷腫瘤細胞，激活中性粒細胞，促進淋巴細胞的分化和增殖，同時可促進淋巴細胞分泌的IL-1β及TNF-α等細胞因子[13]。

許多研究表明，中藥多糖對機體的細胞因子都具有調(diào)節(jié)作用。趙天章等[14]研究了黃芪多糖(APS)對肉仔雞血清免疫細胞因子含量的影響，發(fā)現(xiàn)APS可提高肉仔雞血清IL-1、IL-2、TNF-α的含量。伊瑞卿等[15]研究了枸杞多糖對肉仔雞生產(chǎn)性能和免疫功能的調(diào)節(jié)作用，結(jié)果顯示枸杞多糖能提高雞淋巴細胞IL-1、IL-6、TNF-α mRNA的表達量。孟俊龍等[16]研究表明，姬松茸多糖可提高大鼠脾臟IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α等細胞因子mRNA的表達。李馨等[17]研究表明，北冬蟲夏草多糖可以增加脾臟IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA的表達量，增強機體免疫力。江澤波等[18]研究表明，豬苓多糖可通過TLR4信號通路活化M1巨噬細胞，上調(diào)IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌量，從而起到增強機體免疫力的效應(yīng)。本研究表明，中藥復方多糖能提高IL-1β、TNF-α、IL-8 mRNA的表達量，提示中藥多糖可能通過誘導細胞因子的產(chǎn)生，增強機體的抗感染能力。當然，中藥多糖雖然能促進機體IL-1β、IL-8、TNF-α mRNA表達，但是并非越高越好，三者之間必須處于一定的平衡狀態(tài)，才能維持機體正常的生命活動，否則會發(fā)生自身免疫疾病等嚴重癥狀。

3.2 雞MHC B-LβⅡ基因多態(tài)性對cCHMPS促進淋巴細胞IL-1β、TNF-α、IL-8 mRNA表達量的劑量影響

雞MHC基因家族在機體內(nèi)發(fā)揮著極其重要和十分廣泛的生物學功能，同時雞MHC抗原在體液免疫和細胞免疫中均有重要作用。雞MHC抗原在體液免疫和細胞免疫發(fā)揮著很重要的作用。每個個體細胞表面的MHC抗原都具有特異性，是自身識別的標志，能強烈排斥外來異物。T細胞表面有抗原結(jié)合的受體，簡稱TCR(T cell receptor)。TCR具有特異性，只與特定的抗原結(jié)合， TCR只識別結(jié)合在自身MHC分子上的抗原。大多數(shù)T細胞含有CD4和CD8膜分子，表達的CD4 T細胞只識別MHC Ⅱ類分子遞呈的抗原。CD4 T細胞做為輔助性T細胞(Th)，通過識別抗原遞呈細胞(antigen-presenting cell，APC)MHCⅡ類分子遞呈的抗原而被活化，活化后的Th細胞分裂增殖，同時分泌各種細胞因子，參與調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。此外，T細胞在識別外來抗原同時，還要識別MHC分子，說明T細胞受體在識別抗原時需要依賴抗原遞呈的MHC分子[3]。

雞MHC B-Lβ Ⅱ基因具有豐富的多態(tài)性和功能特異性，是人們研究抗病基因的主要候選基因之一。李福偉等[19]研究表明個體以及品種之間存在不同免疫能力的遺傳差異，并且不同的免疫性狀存在顯著的優(yōu)勢基因型。李尚民[20]等的研究表明雞MHC B-Lβ Ⅱ基因外顯子2的遺傳變異對京海黃雞抗病能力影響顯著，可作為球蟲抗病能力選育候選基因。劉立波[21]等研究了雞MHC B-L基因SNPs單倍體型與血清中IgG含量、LPS含量、禽流感(AI)抗體滴度等免疫性狀關(guān)系，結(jié)果表明不同免疫性狀存在顯著相關(guān)的優(yōu)勢SNPs單倍型。楊紅洋等[22]研究了中藥復方多糖對不同MHC B-Lβ Ⅱ基因型雞血清細胞因子質(zhì)量濃度的影響，發(fā)現(xiàn)MHC B-Lβ Ⅱ基因多態(tài)性使雞血清細胞因子IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α質(zhì)量濃度產(chǎn)生差異。本次試驗發(fā)現(xiàn)，在同一劑量的cCHMPS中，不同MHC B-L β Ⅱ基因型雞，其淋巴細胞中IL-1β、IL-8、TNF-α mRNA表達量差異顯著，此研究結(jié)果與李福偉、李尚民、劉立波、楊紅洋等人的究結(jié)果相一致，說明不同免疫能力存在個體水平上的差異，并且在不同基因型雞中，最有效的提高雞淋巴細胞的細胞因子mRNA表達量的cCHMPS劑量略有不同。

從本試驗得出中藥復方多糖可以通過促進細胞因子的分泌來提高機體免疫力且其生物活性有一定的劑量范圍，同時MHC B-Lβ Ⅱ基因多態(tài)性使不同個體雞的免疫能力產(chǎn)生差異。

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