王 靜

(鄭州工商學(xué)院，河南鄭州 451400)

桑葚又稱桑果，成熟果實(shí)可以當(dāng)水果食用，有甜味且汁多。桑葚中含有大量花青素，具有抗氧化性并且營(yíng)養(yǎng)價(jià)值比較高，是一種營(yíng)養(yǎng)佳品[1]。桑葚中的花青素，有著色價(jià)高、抗氧化性強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。

近些年脊髓損傷的發(fā)病率越來(lái)越高[2]，脊髓損傷所造成的外傷性截癱是外傷中最為嚴(yán)重的。從脊髓損傷病理的角度對(duì)脊髓損傷后的運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)研究受到了廣泛關(guān)注。脊髓損傷有原發(fā)性脊髓損傷和繼發(fā)性脊髓損傷兩種。原發(fā)性脊髓損傷多指機(jī)體由于受到機(jī)械性壓迫或者局部出血導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞直接損傷[3]。繼發(fā)性脊髓損傷是指多種神經(jīng)生化機(jī)制以及微血管機(jī)制互相作用，使病情持續(xù)惡化的持續(xù)性損傷[4]。另外，機(jī)體電解質(zhì)鈣離子聚集、代謝紊亂以及脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)都可能直接導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞壞死，最終造成繼發(fā)性脊髓損傷。原發(fā)性脊髓損傷大多不可逆，但是繼發(fā)性脊髓損傷在一定程度上是可逆的。繼發(fā)性脊髓損傷對(duì)機(jī)體的傷害程度甚至超越了原發(fā)性脊髓損傷。體育運(yùn)動(dòng)是造成脊髓損傷的起因之一，有研究顯示[5]，體育訓(xùn)練在橄欖球、冰球、體操、跳水、足球、騎車、曲棍球等體育項(xiàng)目均有可能操作不當(dāng)或者某些突發(fā)意外造成脊髓損傷。在脊髓損傷早期進(jìn)行干預(yù)治療，防治繼發(fā)性脊髓損傷病理改變是研究的主要方向[6]。

本文主要以成年大鼠為試驗(yàn)對(duì)象，隨機(jī)分為4個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組，人為制造脊髓損傷模型，每天為大鼠服用等同劑量的不同工藝花青素飲品(對(duì)照組給予等量生理鹽水)，以術(shù)后第1天、術(shù)后第5天、術(shù)后第7天、術(shù)后第14天以及術(shù)后第21天為試驗(yàn)節(jié)點(diǎn)分別處死A、B、C、D、E每組5只大鼠，記錄大鼠BBB評(píng)分、斜板試驗(yàn)結(jié)果、SOD以及MDA活性等指標(biāo)，分析不同工藝配制的桑葚花青素飲品對(duì)脊髓損傷運(yùn)動(dòng)功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 新鮮桑葚，采購(gòu)于大連市旅順開發(fā)區(qū)，剔除雜質(zhì)后低溫保存；桑葚果汁，采購(gòu)于中良貿(mào)易有限公司,濃度為55%。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取成年大鼠75只，雌雄皆可，體重在192.6 g～210.3 g，Bale/c品系。隨機(jī)分成5組，分別是鮮桑葚A組、鮮桑葚B組、果汁C組、果汁D組以及對(duì)照組E組，每組15只。再將每組的15只大鼠分為1、5、7、14、21 d共5個(gè)亞組，每個(gè)亞組3只大鼠。

1.1.3 主要儀器和設(shè)備 檸檬酸、乙醇購(gòu)買于吳江市互利精細(xì)化工有限公司；AB-8、D101、NKA、X-5打孔樹脂購(gòu)買于上海摩速科學(xué)器材有限公司；海藻糖購(gòu)買于鄭州豐康化工產(chǎn)品有限公司；果膠購(gòu)買于煙臺(tái)安德利果膠股份有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；JA1003N 電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；GZX-9023MBE 數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 方法

1.2.1 方法 將75只成年大鼠隨機(jī)分為5組，A組、B組、C組、D組為試驗(yàn)組，E組為對(duì)照組。全部大鼠進(jìn)行模型制作，人為造成脊髓損傷。試驗(yàn)組每天給予花青素飲品干預(yù)，對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃花青素飲品4mL/只，每天1次，持續(xù)21 d，對(duì)照組僅灌胃生理鹽水，劑量為4mL/只，每天1次，持續(xù)21 d。試驗(yàn)期間A組大鼠死亡1只、D組大鼠死亡1只、E組大鼠死亡1只，死因不詳，推測(cè)可能是由膀胱破損或者器官衰竭所致。在試驗(yàn)第1天、第5天、第7天、第14天4個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)分別隨機(jī)處死每組5只大鼠，在試驗(yàn)期第21天處死每組剩余大鼠。

1.2.2 模型制作 大鼠模型制作之前進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試，確認(rèn)全部大鼠運(yùn)動(dòng)功能正常，如遇到運(yùn)動(dòng)功能不健全的大鼠則需要另行選取運(yùn)動(dòng)功能正常的大鼠替換[7]。行為學(xué)測(cè)試通過(guò)后，用100 mL/L水合氯醛腹腔注射對(duì)全部大鼠麻醉，去背毛后碘伏消毒[8]。以T9棘突處切開皮膚3 cm左右，暴露T9椎骨，小心去除椎板和椎間軟組織，并且用血管鉗咬住T9-T11處脊髓，充分顯露脊髓背側(cè)硬膜。用自制數(shù)字式脊髓損傷動(dòng)物模型制備儀打擊制備脊髓損傷模型，打擊強(qiáng)度為10 g×25 mm。打擊后即刻見大鼠雙后肢發(fā)生不同程度抽搐，尾部甩動(dòng)，隨后完全松弛，標(biāo)志模型制備成功[9]。檢查手術(shù)大鼠呼吸是否異常，如無(wú)任何問題則逐層縫合切口。立即腹腔注射9 g/L氯化鈉注射液9 mL/kg補(bǔ)液。術(shù)后每天腹腔注射8×104U青霉素鈉3 d以防感染。待動(dòng)物清醒后放回飼養(yǎng)籠中單籠飼養(yǎng)。術(shù)后大鼠自由進(jìn)食、飲水，定時(shí)清潔籠具，保持適宜室溫；每天擠壓膀胱排尿3次，直至大鼠能自主排尿[10]。

1.2.3 花青素制備 選取不同花青素制備工藝制作桑葚花青素口服液，對(duì)比花青素飲品對(duì)大鼠運(yùn)動(dòng)功能的影響。原料分別選取新鮮桑葚和桑葚果汁(表1)。

表1 不同條件花青素制備工藝與分組對(duì)照表

1.2.3.1 鮮桑葚A組花青素粗品 將50 mL/L檸檬酸、50 mL/L乙醇配置成溶液[11]，以溶液與水1∶1的比例循環(huán)淋洗桑葚果實(shí)5 min后，靜止浸泡2 min，再逆流強(qiáng)化淋洗；用0.45 μm濾膜洗水精濾；上柱用大孔樹脂AB-8、D101、NKA、X-5介質(zhì)吸附；隨后用500 mL/L乙醇濃度洗脫解吸附，上樣量為每小時(shí)2個(gè)柱體積。最后濃縮、干燥，得花青素粗品[12]。

1.2.3.2 鮮桑葚B組花青素粗品 桑葚果汁用0.45 μm濾膜洗水精濾；上柱用大孔樹脂AB-8、D101、NKA、X-5介質(zhì)吸附；隨后用500 mL/L乙醇濃度洗脫解吸附[13]，上樣量為每小時(shí)2個(gè)柱體積。最后濃縮、干燥，得花青素粗品。

1.2.3.3 桑葚果汁C組花青素粗品 鮮桑葚處理方法同1.2.3.1，洗脫介質(zhì)乙醇濃度為60%。最后濃縮、干燥，得花青素粗品。

1.2.3.4 桑葚果汁D組花青素粗品 桑葚果汁處理方法同1.2.3.2，洗脫介質(zhì)乙醇濃度為60%。最后濃縮、干燥，得花青素粗品。

1.2.3.5 飲品制備 上述4種花青素粗品，用同樣的方法制作飲品，即用蒸餾水溶解花青素粗品(加水量與鮮桑葚或者桑葚果汁等量)，加入海藻糖15 g和果膠1.5 g，經(jīng)過(guò)均質(zhì)、脫氣、罐裝既得高含量桑葚花青素飲品[14]。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本試驗(yàn)采用計(jì)量資料來(lái)測(cè)定各種指標(biāo)的數(shù)值，所有數(shù)據(jù)均采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間試驗(yàn)數(shù)據(jù)比較采用完全隨機(jī)單因素方差分析，組間兩兩比較用p檢驗(yàn)，均以0.05作為顯著性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)[15]。

1.2.5 安全性與不良反應(yīng) 在整個(gè)試驗(yàn)期間，全部大鼠均無(wú)不良反應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)大鼠成活率統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)期間，大鼠自然死亡率5.33%。其中A組死亡1只、D組死亡1只、E組死亡1只，死亡大鼠沒有任何規(guī)律，屬于偶然情況，死因不詳，可能是造模過(guò)程中導(dǎo)致大鼠器官衰竭，也可能是大鼠不能自主排尿擠壓膀胱造成膀胱破裂等(表2)。

表2 試驗(yàn)大鼠剩余情況表

2.2 大鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況BBB評(píng)分

對(duì)大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況評(píng)估采用BBB評(píng)分方式。BBB評(píng)分分別于造模術(shù)后1 d、5 d、7 d、14 d、21 d晚上18：30-19：30進(jìn)行。每次評(píng)分都有2～3個(gè)人參與，平均值記錄為大鼠此次BBB評(píng)分。以亞組為單位，以亞組平均值方式見表3。

表3 BBB評(píng)分記錄表

注：*表示與對(duì)照組相比較差異顯著,P<0.05。

Note:*The difference is significant compared with control group,P<0.05.

造模術(shù)后第1天，5組大鼠的BBB評(píng)分結(jié)果并無(wú)顯著差異。在術(shù)后第5天，A、B、C、D 4組試驗(yàn)組的大鼠運(yùn)動(dòng)功能稍微有些恢復(fù)，BBB評(píng)分和觀察結(jié)果均顯示大鼠后肢各關(guān)節(jié)活動(dòng)逐漸靈活，此時(shí)試驗(yàn)組與對(duì)照組開始呈現(xiàn)明顯差異。術(shù)后第7天，大鼠的運(yùn)動(dòng)功能逐漸好轉(zhuǎn)，試驗(yàn)組大鼠后肢基本恢復(fù)術(shù)前的狀態(tài)，同時(shí)大鼠的步態(tài)已開始協(xié)調(diào)，說(shuō)明桑葚花青素飲品的干預(yù)治療明顯對(duì)脊髓損傷運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)有效果。術(shù)后第14天，大鼠BBB評(píng)分明顯提升很高，此時(shí)大鼠的后肢步態(tài)以及協(xié)調(diào)功能恢復(fù)良好，并且在運(yùn)動(dòng)中大鼠爪子的精細(xì)動(dòng)作也能很好體現(xiàn)，到術(shù)后第21天時(shí)評(píng)分上升趨勢(shì)逐漸平緩。

縱向分析上表，還可以看出，A、B、C、D 4組制作花青素飲品的工藝不同，但是全部對(duì)大鼠脊髓損傷運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)都是有效的，但是A組的效果最為明顯，說(shuō)明A組的桑葚花青素飲品對(duì)脊髓損傷運(yùn)動(dòng)功能的作用最大。

綜上所述，桑葚花青素飲品有助于脊髓損傷運(yùn)動(dòng)功能的康復(fù)治療。不同工藝、不同原材料的選擇對(duì)大鼠脊髓損傷運(yùn)動(dòng)功能的影響也不同，試驗(yàn)證明，用新鮮桑葚，解吸附乙醇濃度50%的工藝對(duì)脊髓損傷運(yùn)動(dòng)功能的輔助功效最顯著。

2.3 斜板試驗(yàn)角度觀察花青素飲品對(duì)脊髓損傷運(yùn)動(dòng)功能的影響

將大鼠放在斜板上，使大鼠平行斜板放置，大鼠頭朝斜板抬高一側(cè)，逐漸抬高斜板，記錄大鼠停留在斜板至少5 s的最大傾斜角度，每只大鼠測(cè)試3次取平均值，再以亞組為單位記錄每個(gè)亞組的平均值(表4)。

表4 大鼠斜板試驗(yàn)臨界角度的平均值數(shù)據(jù)表

注：*表示與對(duì)照組相比較差異顯著,P<0.05。

Note:*The difference is significant compared with control group,P<0.05.

造模手術(shù)術(shù)后前5 d每組小鼠表現(xiàn)基本沒有明顯差異，試驗(yàn)組和對(duì)照組的大鼠斜板測(cè)試臨界角度都在27～29度，表現(xiàn)為大鼠后肢肌肉在術(shù)后前5 d恢復(fù)較慢，桑葚花青素飲品對(duì)大鼠的干預(yù)治療還沒有起到顯著效果。但是從第14天開始花青素對(duì)大鼠脊髓損傷運(yùn)動(dòng)功能干預(yù)出現(xiàn)明顯好轉(zhuǎn)，術(shù)后第7天到術(shù)后第14天療效最明顯，斜板角度升高10度左右，說(shuō)明大鼠脊髓損傷后的第1周到第2周是介入治療的最佳時(shí)期。而術(shù)后21 d的評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，大鼠斜板停留角度上升緩慢，顯示在脊髓損傷后的第3周機(jī)體運(yùn)動(dòng)功能開始逐漸進(jìn)入平穩(wěn)期。

縱向分析，可以看出不同花青素飲品的制作，對(duì)脊髓損傷運(yùn)動(dòng)功能的作用從大到小依次為A>C>B>D，由于有助于大鼠脊髓損傷功能恢復(fù)的有效成分為花青素，所以試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明新鮮桑葚的花青素提取率要高于桑葚果汁的花青素提取率，在提取粗品過(guò)程中解脫附的乙醇濃度選擇50%最佳。

2.4 桑葚花青素飲品對(duì)大鼠血清SOD和MDA活性的影響

脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)是繼發(fā)性脊髓損傷誘發(fā)的因素之一，血清SOD活性和MDA活性能夠間接反映出服用桑葚花青素飲品后大鼠體內(nèi)抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)和清除自由基的能力，從而判斷大鼠脊髓損傷的恢復(fù)情況。對(duì)試驗(yàn)大鼠血清SOD、MDA活性檢測(cè)數(shù)據(jù)以每個(gè)亞組平均值形式顯示(表5)。

表5 血清SOD、MDA活性變化記錄

注：*表示與對(duì)照組相比較差異顯著,P<0.05。

Note:*The difference is significant compared with control group,P<0.05.

4組試驗(yàn)組的大鼠術(shù)后血清SOD活性在術(shù)后第1天就與對(duì)照組出現(xiàn)明顯差異，說(shuō)明花青素飲品的供給能在短時(shí)間就對(duì)大鼠體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)有抑制作用。大鼠血清MDA活性結(jié)果顯示在大鼠術(shù)后第1天就出現(xiàn)了降低的趨勢(shì)，這與血清SOD活性的試驗(yàn)結(jié)果相符。而A、B、C、D4個(gè)試驗(yàn)組對(duì)脊髓損傷運(yùn)動(dòng)功能的作用趨勢(shì)也呼應(yīng)了大鼠BBB評(píng)分、大叔斜板試驗(yàn)的試驗(yàn)結(jié)果。證實(shí)A組的工藝使用新鮮桑葚，解脫附時(shí)用500 mL/L乙醇濃度洗脫能最大限度提取花青素，說(shuō)明A組的工藝配制桑葚花青素飲品最優(yōu)。

3 討論

花青素能夠在抑制機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)以及機(jī)體自由基清除方面發(fā)揮作用，達(dá)到治療脊髓損傷運(yùn)動(dòng)功能的目的，從而恢復(fù)脊髓損傷運(yùn)動(dòng)功能。試驗(yàn)結(jié)果也表明不論從大鼠BBB評(píng)分、大鼠斜板試驗(yàn)以及血清SOD活性和MDA活性方面，桑葚花青素飲品對(duì)大鼠脊髓損傷運(yùn)動(dòng)功能均有改善的作用。由于將桑葚花青素制作成為高濃度花青素飲料，口感以及服用效果對(duì)患者來(lái)說(shuō)都更加方便。不同工藝對(duì)桑葚花青素的提取率不同，對(duì)機(jī)體的作用效果也不同。本試驗(yàn)顯示A組使用新鮮桑葚強(qiáng)化淋洗精濾后用500 mL/L乙醇濃度洗脫解吸附的工藝對(duì)桑葚花青素的提取率最高，制成的飲品對(duì)機(jī)體脊髓損傷運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)效果最好。由于原花青素對(duì)脊髓損傷的治療效果是否呈劑量依賴也不清楚，還需更全面的研究來(lái)探索最佳劑量。

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