徐啟明吳南,2,3陳易新崔麗嘉牛宇辰李孝鑫沈建雄,2,3仉建國,2,3吳志宏邱貴興,2,3**

（1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院骨科，北京100730；2.北京市骨骼畸形遺傳學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100730；3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院骨科研究中心，北京100730；4.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院，北京100037；5.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京100730；6.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，北京100730）

脊柱側(cè)凸是一種發(fā)生于脊柱的三維畸形，其特征是脊柱側(cè)凸角度（Cobb測量法）＞10°并伴有椎體的旋轉(zhuǎn)畸形[1]。脊柱側(cè)凸可分為先天性脊柱側(cè)凸、繼發(fā)性脊柱側(cè)凸和特發(fā)性脊柱側(cè)凸（idiopathic scoliosis,ⅠS）。其中，先天性脊柱側(cè)凸指由胚胎期脊柱發(fā)育畸形導(dǎo)致的脊柱序列偏移，如未分節(jié)骨橋、半椎體及楔形椎等畸形等[2,3]；繼發(fā)性脊柱側(cè)凸指有明確病因的脊柱序列偏移，如肌萎縮、脊髓灰質(zhì)炎、肌強(qiáng)直等[4,5]；ⅠS指既無胚胎期脊柱畸形也無其他明確病因的脊柱側(cè)凸。其中，青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸發(fā)病于10~16歲，是最多見的ⅠS，占所有脊柱側(cè)凸的80%[1]。與繼發(fā)性脊柱側(cè)凸比較，先天性脊柱側(cè)凸和ⅠS的病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確，導(dǎo)致相關(guān)脊柱側(cè)凸的預(yù)防、早期診斷及治療存在較大難度。

目前已有大量針對ⅠS病因?qū)W的研究，其中有些研究[6,7]提示，遺傳因素可能在ⅠS的發(fā)病過程中起著重要作用。ⅠS的家族聚集性發(fā)病在特發(fā)性脊柱側(cè)凸中占有較高的比例[8-12]，提示ⅠS具有一定的遺傳特性。ⅠS的遺傳模式不詳，其可能受到易感基因和環(huán)境因素的雙重調(diào)控[13]。盡管也有報道認(rèn)為存在ⅠS的單基因亞型，然而用于證明這些單基因遺傳模式的大型ⅠS家系的數(shù)量極少，導(dǎo)致ⅠS的單基因遺傳模式難以復(fù)制和驗(yàn)證。近期，越來越多的學(xué)者[14,15]認(rèn)為，ⅠS的發(fā)病過程受到不同基因位點(diǎn)的等位基因影響。有些研究[16]發(fā)現(xiàn)某些基因位點(diǎn)在ⅠS患者中具有顯性遺傳特性，包括5q13-q14、3q11-q13、9q34、17q25、17q25、18q 和19p13.3等。另外，一些全基因組關(guān)聯(lián)性研究（genomewide association studies,GWAS）成功地確定ⅠS的新發(fā)易感基因，包括G蛋白受體-126（protein-coupled receptor 126,GPR126），瓢蟲同源框-1（ladybird homeobox 1,LBX1），成對盒基因-1（paired box 1,PAX1），鋅指結(jié)構(gòu)蛋白堿核蛋白-2（zinc finger protein basonuclin 2,BNC2），以及中心粒蛋白體-5（proteome of centrioles 5,POC5）[17-21]。Liu等[7]在中國北方漢族青少年ⅠS患者中檢測到2個LBX1基因附近的SNP，并使用熒光素酶技術(shù)證實(shí)了其中的1個SNP能夠下調(diào)LBX1信使RNA反義RNA的轉(zhuǎn)錄，從而提高LBX1基因的功能。Liu等[22]在中國北方漢族青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸患者中檢測到3個與之明顯關(guān)聯(lián)的GPR126基因SNP，并發(fā)現(xiàn)其中2個SNP和青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸協(xié)和分型（PUMC classification）之間存在相關(guān)性。然而，這些研究并沒有完全解釋特發(fā)性脊柱側(cè)凸的病因?qū)W機(jī)制[6,23]。

Patten等[21]最近成功地將ⅠS的致病性基因定位在染色體5q13.3或3q12.3，并在ⅠS患者中檢測到產(chǎn)生功能的POC5基因突變。他們通過對3個ⅠS家系和8個ⅠS散發(fā)患者的基因測序，報道了3個位于POC5基因第10外顯子[參考序列號：NM_001099271]上的錯義突變位點(diǎn)，分別是c.C1286T（p.A429V）、c.G1336A（p.A446T）和c.G1363C（p.A455P），進(jìn)一步功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明上述突變可以導(dǎo)致斑馬魚的脊柱產(chǎn)生輕、中、重度不同比例的側(cè)凸畸形。他們在基因?qū)用嫔详P(guān)于ⅠS病因?qū)W的研究成果具有突破性進(jìn)展，然而只是局限于高加索人群。在此基礎(chǔ)上，Xu等[24]對大樣本中國人群青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸患者進(jìn)行POC5基因報道的上述3個陽性位點(diǎn)進(jìn)行測序分析，并未發(fā)現(xiàn)Patten等報道的3個突變位點(diǎn)或其他新發(fā)罕見突變位點(diǎn)。進(jìn)一步針對該區(qū)域的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms,SNP）關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，rs6892146位點(diǎn)可能與ⅠS相關(guān)（患者vs對照：1446 vs 2080，P=0.004）。常見SNP和罕見突變都可能對疾病的遺傳性有貢獻(xiàn)[25,26]。為了檢測中國人群脊柱側(cè)凸患者中是否存在POC5基因的罕見變異，我們對中國漢族人群患者進(jìn)行基因測序。

1 資料與方法

1.1 臨床資料及納入、排除標(biāo)準(zhǔn)

本研究經(jīng)北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，選取2010年10月至2017年10月于我院住院并診斷為ⅠS的121例中國漢族患者納入研究，其中男性23例，女性98例，發(fā)病年齡1~22歲，平均12.7歲。所有患者均簽署知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)：明確診斷為脊柱側(cè)凸的患者，包括體格檢查中的前屈試驗(yàn)（Adam試驗(yàn)）陽性，且全脊柱X線片顯示脊柱側(cè)凸度數(shù)（Cobb測量法）＞20°并伴有椎體旋轉(zhuǎn)（高于ⅠS的診斷標(biāo)準(zhǔn)，為了避免因環(huán)境因素引起的擬表型）。對于側(cè)凸度數(shù)＞20°但不伴有椎體旋轉(zhuǎn)者，可能伴有潛在的椎體畸形或系椎間盤突出等引起的脊柱側(cè)凸，視為非典型側(cè)凸而不予納入。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①先天性脊柱畸形者（未分節(jié)骨橋、半椎體及楔形椎等畸形）；②神經(jīng)肌肉型脊柱側(cè)凸（Duchenne肌萎縮、Friedrich共濟(jì)失調(diào)、神經(jīng)纖維瘤病、腦性癱瘓、脊柱裂、脊髓灰質(zhì)炎、肌強(qiáng)直等）；③外傷性脊柱側(cè)凸；④退行性脊柱側(cè)凸；⑤脊柱側(cè)凸合并其他系統(tǒng)疾病者（如Goldenhar綜合征，Klippel-Feil綜合征，F(xiàn)reeman-Sheldon綜合征，Marfan綜合征，Larsen綜合征等）。

選取50名與實(shí)驗(yàn)組無相關(guān)性的健康中國漢族人群作為隨機(jī)對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①體格檢查中的前屈試驗(yàn)（Adam試驗(yàn)）陰性，且全脊柱X線片顯示脊柱無側(cè)凸；②經(jīng)檢查除外有骨骼系統(tǒng)遺傳性疾病及其他系統(tǒng)疾病。

1.2 聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction,PCR）及結(jié)果分析

用Puregene 158389血液提取工具（Qiagen公司）從外周靜脈血中提取全基因組DNA。首先，從實(shí)驗(yàn)組中隨機(jī)抽取10例中國漢族ⅠS畸形患者，用FastStart聚合酶鏈反應(yīng)（Roche公司）及外部引物（表1）對其POC5基因的所有外顯子進(jìn)行擴(kuò)增，隨后用同樣的方法對剩余的111例患者和50名對照組受試者POC5基因的第10外顯子進(jìn)行序列擴(kuò)增。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：45°C 30 min，94°C 2 min，（94°C 30 s，50°C 30 s，72°C 90 s）×35循環(huán)，72°C 10 min。最終的PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測符合參考序列的分子量，并對基因序列進(jìn)行正向及反向Sanger測序。使用CodonCode Aligner 6.0.2軟件對DNA測序結(jié)果進(jìn)行分析[參考序列號：NM_001099271]。

表1 用于POC5基因擴(kuò)增的引物序列

2 結(jié)果

在Patten等的研究中，3個POC5基因突變位點(diǎn)在ⅠS中的致病性通過基因測序及斑馬魚功能驗(yàn)證得到了證實(shí)，然而在中國漢族人群中并未發(fā)現(xiàn)這些突變位點(diǎn)。我們在2個ⅠS患者的POC5基因第10外顯子中檢測到另外2個未經(jīng)報道的罕見錯義突變位點(diǎn)，分別是c.C1139T（p.S380F）和c.A1132T（p.Ⅰ378L）（圖1），而在對照組中未發(fā)現(xiàn)POC5基因第10外顯子的基因突變。c.C1139T（p.S380F）突變導(dǎo)致密碼子TCC（絲氨酸）轉(zhuǎn)變?yōu)槊艽a子TTC（苯丙氨酸），c.A1132T（p.Ⅰ378L）突變導(dǎo)致密碼子ATA（異亮氨酸）轉(zhuǎn)變?yōu)槊艽a子TTA（亮氨酸）。通過檢索NCBⅠ的dbSNP數(shù)據(jù)庫，顯示c.A1132T（p.Ⅰ378L）在千人基因組計劃和ExAc數(shù)據(jù)庫中無相關(guān)報道；雖然c.C1139T（p.S380F）在千人基因組計劃和ExAc數(shù)據(jù)庫中有過報道（rs141696191），但其在ExAc數(shù)據(jù)庫的等位基因頻率僅為0.001402，提示為罕見突變，可能具有致病性。

根據(jù)測序結(jié)果，回顧c.C1139T（p.S380F）和c.A1132T（p.Ⅰ378L）兩個POC5基因錯義突變的ⅠS患者病歷，并總結(jié)其主要病例特點(diǎn)（表2）。2個女患者都是在14歲被診斷為ⅠS，無明確的脊柱側(cè)凸致病原因或相關(guān)家族病史。其中突變c.A1132T（p.Ⅰ378L）對應(yīng)的患者脊柱存在主胸彎及胸腰彎，側(cè)凸Cobb角分別為64°及87°，頂椎分別位于T6及L1水平。c.C1139T（p.S380F）對應(yīng)的患者脊柱存在上胸彎及主胸彎，側(cè)凸Cobb角分別為53°及58°，頂椎分別位于T2/3及T9/10椎間盤水平。2例患者在就診時都存在較大的生長潛能，側(cè)凸度數(shù)較大且具有進(jìn)一步發(fā)展的可能，均接受了脊柱后路矯形、植骨融合內(nèi)固定術(shù)，手術(shù)過程順利，術(shù)后矯形效果良好。

3 討論

ⅠS可能是一個受到多基因影響的疾病。研究者們曾經(jīng)試圖通過全基因連鎖分析，在ⅠS和某些基因之間尋找到關(guān)聯(lián)性[16,27,28]，然而迄今為止尚未取得成功。進(jìn)而，全基因組關(guān)聯(lián)性研究（genome-wide association studies,GWAS）被用于比較某些特異性基因多態(tài)性在實(shí)驗(yàn)組和對照組之間的差異性，以篩選其中可增加ⅠS易感性的特異性基因多態(tài)性[19,20,29]。Patten等的報道表明，POC5基因變異在家系及散發(fā)患者中均有存在，并利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)基于突變位點(diǎn)成功構(gòu)建出斑馬魚動物模型。Xu等[24]首先報道了POC5基因突變和中國人群青少年ⅠS的相關(guān)性研究，然而他們并沒有發(fā)現(xiàn)Patten等在高加索ⅠS人群中發(fā)現(xiàn)的POC5基因罕見變異或其他新發(fā)突變。他們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)SNP（rs6892146）的表達(dá)在ⅠS人群和健康人群中有顯著差異，但該SNP位于POC5的內(nèi)含子區(qū)域。Xu等認(rèn)為其可能作為增強(qiáng)子促進(jìn)了POC5基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而對脊柱側(cè)凸的發(fā)病過程產(chǎn)生作用，但和位于外顯子的罕見突變位點(diǎn)比較，SNP變異rs6892146對疾病的遺傳貢獻(xiàn)目前不詳。

圖1 POC5基因錯義突變位點(diǎn)在ⅠS患者中的分布情況

盡管本研究也未檢測出Patten等在高加索ⅠS患者中報道的POC5基因突變，但值得注意的是，我們首次在中國漢族人群ⅠS患者中檢測出POC5基因第10外顯子上的2個罕見變異。此外，我們還對隨機(jī)抽取的10例患者的DNA樣本進(jìn)行POC5基因的全部外顯子測序，未發(fā)現(xiàn)在第10外顯子之外的外顯子部位存在變異。本研究報道的突變位點(diǎn)和Patten等報道的突變位點(diǎn)都位于POC5基因的第10外顯子，且前者集中于第10外顯子的起始端，后者集中于中、末端。這些突變位點(diǎn)在第10外顯子上的非隨機(jī)分布（圖1），提示第10外顯子對應(yīng)的POC5蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可能在脊柱發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用。雖然本研究檢測到POC5基因的罕見變異尚不能直接得出其對脊柱側(cè)凸的致病性，但為POC5基因和ⅠS關(guān)聯(lián)性的進(jìn)一步研究鎖定在第10外顯子提供了新的依據(jù)。

POC5基因所表達(dá)的中心粒蛋白體-5是一種中心粒結(jié)合蛋白，其位于中心粒中并在中心粒成熟、細(xì)胞分裂和極化過程中起到重要作用，POC5是人類中心粒的遠(yuǎn)端部分的必需組成部分。在分裂前期/分裂期（G2/M）臨界節(jié)點(diǎn)，POC5轉(zhuǎn)化成中心粒前體以促使中心粒的成熟[30]。研究[30]表明POC5缺失細(xì)胞在G1期停止或細(xì)胞死亡。既然POC5對于細(xì)胞進(jìn)入分裂前期（G2）期起著關(guān)鍵作用，我們有理由相信它可能生長和發(fā)育過程中也起著重要作用。有研究[31]發(fā)現(xiàn)，POC5功能異常和哺乳動物的纖毛相關(guān)疾病相關(guān)，提示其也可能影響骨骼系統(tǒng)的發(fā)育。ⅠS的度數(shù)進(jìn)展和骨的不均衡生長有關(guān)。POC5在細(xì)胞分裂和增殖中起著重要的作用，因此，我們有理由推測POC5結(jié)構(gòu)和功能受到任何的紊亂可能在骨發(fā)育過程中引起椎體生長的失調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致脊柱序列在冠狀面出現(xiàn)弧度。雖然Pattern等[21]通過與人類基因高度同源的斑馬魚實(shí)施了功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，認(rèn)為POC5的變異可能導(dǎo)致脊柱側(cè)凸，我們認(rèn)為構(gòu)建哺乳動物的POC5基因突變導(dǎo)致脊柱側(cè)凸的動物模型或許會對POC5對ⅠS的貢獻(xiàn)提供進(jìn)一步的證據(jù)。

本研究僅隨機(jī)選取10例患者POC5基因的全部外顯子進(jìn)行測序以初步驗(yàn)證我們的猜測。在條件允許的情況下，我們將在今后的研究中對所有樣本的POC5基因進(jìn)行全外顯子測序。另一方面，我們當(dāng)前的假設(shè)是疾病的表型和基因的外顯子而非內(nèi)含子相關(guān)，正是基于這個假想我們才只對POC5基因的外顯子進(jìn)行測序。內(nèi)含子是否在脊柱側(cè)凸的發(fā)展過程中起作用尚有待證實(shí)。ⅠS是一個有多基因背景的復(fù)雜骨骼畸形，POC5基因突變是否在ⅠS發(fā)病過程中起決定性作用，還有待于利用全外顯子組測序技術(shù)(whole exome sequence,WES)排查ⅠS患者是否在POC5基因突變之外存在其他導(dǎo)致骨骼畸形的基因變異。此外，對POC5突變基因所編碼的蛋白進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)解析，更有助于說明相應(yīng)突變導(dǎo)致的蛋白結(jié)構(gòu)及功能改變在脊柱側(cè)凸的發(fā)生發(fā)展過程中所起的作用。本研究中發(fā)現(xiàn)中國漢族人群ⅠS患者中存在POC5基因的錯義突變，與以往文獻(xiàn)中的報道不同，為POC5突變與ⅠS的發(fā)病相關(guān)性提供了新的證據(jù)。進(jìn)一步驗(yàn)證還需要多中心、更大樣本的篩查，以及細(xì)胞學(xué)與動物模型的構(gòu)建等相關(guān)工作。

表2 攜帶POC5基因第10外顯子錯義突變位點(diǎn)的2例ⅠS患者的臨床信息

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