丁金國 賈存宇 黃臻輝

摘 要 目的：建立反相高效液相色譜法（RP-HPLC）分析二丁酰環(huán)磷腺苷鈣的有關(guān)物質(zhì)，并對(duì)其中的雜質(zhì)進(jìn)行鑒定。方法：采用反相梯度色譜系統(tǒng)對(duì)二丁酰環(huán)磷腺苷鈣中的有關(guān)雜質(zhì)進(jìn)行分離，對(duì)其中的主要雜質(zhì)采用四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（Q-TOF）進(jìn)行多級(jí)質(zhì)譜分析，鑒定結(jié)構(gòu)。并采用紅外光譜、核磁進(jìn)一步確證。結(jié)果：在該條件下，二丁酰環(huán)磷腺苷鈣主峰與有關(guān)物質(zhì)分離良好，其中的主要有關(guān)物質(zhì)鑒定為2′-O-單丁酰環(huán)磷酰苷鈣。結(jié)論：本研究為二丁酰環(huán)磷腺苷鈣有關(guān)物質(zhì)研究提供了新的分析方法，可用于二丁酰環(huán)磷腺苷鈣的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞 二丁酰環(huán)磷腺苷鈣 有關(guān)物質(zhì) HPLC Q-TOF

中圖分類號(hào)：R917 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2018）09-0073-04

Analysis and identification of the related impurities in the calcium dibutyryladenosine cyclophosphate

DING Jinguo*， JIA Cunyu， HUANG Zhenhui

（SPH No.1 Biochemical & Pharmaceutical Co.， Ltd.， Shanghai 200240， China）

ABSTRACT Objective： To establish an HPLC method for the analysis and identification of related impurities in calcium dibutyryladenosine cyclophosphate. Methods： The related impurities were isolated by reversed-phase high-performance chromatography， in which the major impurities were identified by Q-TOF and verified by IR and NMR. Results： The related impurities were well separated and the major impurity was identified as 2′-O-butyryladenosine cyclophosphate. Conclusion： The established method for the analysis of the related impurities can be used for the quality control of calcium dibutyryladenosine cyclophosphate.

KEy WORDS calcium dibutyryladenosine cyclophosphate； related impurities； HPLC； Q-TOF

環(huán)磷腺苷具有體內(nèi)激素的傳導(dǎo)功能，對(duì)許多生理過程起著重要調(diào)節(jié)作用，如心肌細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷腺苷的升高會(huì)引起正性肌力效應(yīng)，也作為藥物用于心血管疾病治療[1]。二丁酰環(huán)磷腺苷鈣是環(huán)磷腺苷的N6-2′-O-二丁?；苌?，脂溶性增強(qiáng)，有利于穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮藥理作用。二丁酰環(huán)磷腺苷在細(xì)胞內(nèi)代謝為環(huán)磷腺苷，也能抑制磷酸二酯酶對(duì)環(huán)磷腺苷的快速降解，從而增加細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷腺苷濃度，藥效比環(huán)磷腺苷迅速，作用也較持久，且具有更佳體內(nèi)藥物濃度分布和代謝動(dòng)力學(xué)特性。臨床上廣泛用于心絞痛、急性心肌梗死的治療，也用于心肌炎、心源性休克，手術(shù)后網(wǎng)膜下出血和銀屑病，并可輔助其他抗癌藥治療白血病[2-6]。

本文建立了反相高效液相色譜法對(duì)二丁酰環(huán)磷腺苷鈣中的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行分離，并對(duì)主要有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，為二丁酰環(huán)磷酰苷鈣質(zhì)量控制提供專屬、快捷的分析方法，也為改進(jìn)工藝控制、減少有關(guān)物質(zhì)生成提供了研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

色譜級(jí)甲酸銨購自美國Fluka公司；色譜級(jí)甲酸購自美國ROE公司；色譜級(jí)乙腈購自美國Fisher公司；二丁酰環(huán)磷酰苷鈣為本公司自制產(chǎn)品；水為雙蒸水。

1.2 儀器

Waters alliance 2695高效液相色譜儀、 Waters 2489 UV/ Vis檢測器和Empower 2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)、Acquity UPLCQTOF Premier超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀和Masslynx數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)均購自美國Waters公司；XS-205 DU電子天平（梅特勒-托利多中國公司）； Nicolet 6700傅里葉紅外光譜分析儀（美國Thermo-Fisher Scientific公司）；Avance Ⅲ 400 MHz核磁共振波譜儀（德國Bruck公司）。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性

色譜柱：Diamonsil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 mm）；流動(dòng)相A為甲酸-甲酸銨水溶液（緩沖鹽濃度10 mol/L，pH 3.0）-乙腈（90∶10），流動(dòng)相B為乙腈；梯度洗脫條件：0～5 min時(shí)流動(dòng)相B從0%增加到15%，5～10 min時(shí)B從15%增加到22%，10～11 min時(shí)B從22%增加到25%，11～12 min時(shí)B從25%增加到30%，12～13 min時(shí)B從30%增加到90%，13～17 min時(shí)B為90%，17.5 min時(shí)B回到0%；流速：1 ml/min；柱溫：30 ℃ ；檢測波長：273 nm；進(jìn)樣量：20 ml。此條件下二丁酰環(huán)磷酰苷鈣主峰的保留時(shí)間為11.5 min左右，主峰與前后雜質(zhì)峰分離度大于1.5，理論塔板數(shù)按主峰計(jì)算大于10 000。

1.3.2 供試品貯備液

精密稱取二丁酰環(huán)磷酰苷鈣50 mg，置50 ml量瓶中，加流動(dòng)相A溶解并稀釋至刻度，搖勻，得到1 mg/ml溶液作為供試品貯備液。

1.3.3 方法專屬性考察

1）各組分分離情況 精密稱取樣品粗品，配成1 mg/ml粗品溶液，進(jìn)樣20 ml，記錄色譜圖。

2）強(qiáng)制降解試驗(yàn) 分別將樣品進(jìn)行酸、堿、氧化、高溫、強(qiáng)光照射等強(qiáng)制降解試驗(yàn)，依次進(jìn)樣20 ml，按1.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析并記錄色譜圖。①酸破壞：稱取樣品約20 mg，置20 ml量瓶中，加1 mol/L的鹽酸溶解，室溫放置1 h，并用適量氫氧化鈉溶液中和，再用流動(dòng)相A稀釋至刻度，搖勻并進(jìn)樣；②堿破壞：稱取樣品約20 mg，置20 ml量瓶中，加10 mmol/L的氫氧化鈉溶液溶解，室溫放置10 min，并用相應(yīng)的鹽酸溶液中和，再用流動(dòng)相A稀釋至刻度，搖勻并進(jìn)樣；③氧化降解：稱取樣品約20 mg，置20 ml量瓶中，加10%雙氧水溶液溶解，室溫放置0.5 h，再用流動(dòng)相A稀釋至刻度，搖勻并進(jìn)樣；④高溫破壞：取供試品貯備液10 ml，于100 ℃水浴加熱3 h后取出，冷卻至室溫進(jìn)樣；⑤強(qiáng)光破壞：取供試品貯備液10 ml，于4 500 Lx ± 500 Lx下放置6 d進(jìn)樣。

1.3.4 質(zhì)譜分析

將二丁酰環(huán)磷腺苷鈣進(jìn)行熱破壞降解，在HPLC上過載上樣對(duì)其進(jìn)行富集，通氮?dú)馐節(jié)饪s得到一定量的雜質(zhì)純品，進(jìn)行質(zhì)譜分析。

色譜柱為Waters Acquity BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm， 1.7 mm），串聯(lián)質(zhì)譜離子源為電噴霧離子源，正離子模式，毛細(xì)管電壓為3.0 kV，離子源溫度為100 ℃，霧化氣溫度為350 ℃，霧化氣流量為600.0 L/h，碰撞電壓分別為4.0 eV（MS）和15.0～30.0 eV（MS/MS），掃描范圍m/z 100～1 000。

1.3.5 紅外光譜和核磁條件

紅外光譜采用KBr壓片制樣。核磁共振采用氘代DMSO為溶劑。

2 結(jié)果

2.1 色譜分離及方法專屬性考察

采用粗品進(jìn)行1.3.1所述色譜方法專屬性考察，觀察各組分之間的分離情況，色譜圖見圖1。結(jié)果表明，在該色譜條件下，二丁酰環(huán)磷腺苷鈣主峰與各雜質(zhì)峰分離度良好。

各強(qiáng)制降解試驗(yàn)獲得的降解產(chǎn)物的色譜圖見圖2，發(fā)現(xiàn)二丁酰環(huán)磷腺苷鈣對(duì)酸、氧化、熱和光照比較穩(wěn)定，對(duì)堿反應(yīng)比較靈敏，稀堿溶液處理10 min后降解較劇烈，相關(guān)雜質(zhì)增加明顯，但各條件下主峰與前后雜質(zhì)峰分離度良好，分離度均大于1.5，不干擾樣品的測定，表明該方法專屬性良好。

2.2 質(zhì)譜檢測結(jié)果

在二丁酰環(huán)磷腺苷鈣色譜圖中，保留時(shí)間7.9～8.1 min左右處有一雜質(zhì)峰，為其主要有關(guān)物質(zhì)，對(duì)該雜質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜分析表明，正離子模式下，一級(jí)質(zhì)譜m/z 400.102 9為準(zhǔn)分子離子峰[ M + H ]+。經(jīng)軟件測算，分子式C14H19N5O7P的匹配誤差小于百萬分之2，初步推斷為N6-單丁酰環(huán)磷腺苷或2′-O-單丁酰環(huán)磷腺苷。[ M+ H ]+經(jīng)低能碰撞誘導(dǎo)解離，得到五個(gè)主要碎片離子信息?？赡艿牧呀庖?guī)律如圖3所示，其中m/z 136.06 0相應(yīng)分子式為C5H6N5 （圖3 A），即腺嘌呤；m/z 265.043相應(yīng)分子式為C9H14O7P（圖3 B），即2′-O-丁酰化環(huán)磷酸核糖殘基，二者為單丁酰環(huán)磷腺苷的C-N糖苷鍵斷裂所致；然后結(jié)構(gòu)B上2′-位酯鍵斷裂失去丁?；?，得到相應(yīng)碎片離子m/z 195.005，分子式為C5H8O6P（圖3 C）；再經(jīng)失水重排、脫HPO3產(chǎn)生碎片離子m/z 97.027 7 和m/z 176.994，相應(yīng)的分子式依次為C5H6O5P（圖3 D）、C5H5O2（圖3 E）。從二級(jí)質(zhì)譜信息中未發(fā)現(xiàn)N6-丁酰化有關(guān)的碎片峰。通過上述分析可初步判斷二丁酰環(huán)磷腺苷鈣的主要有關(guān)物質(zhì)為2′-O-單丁酰環(huán)磷腺苷。

2.3 紅外光譜和核磁共振分析

IR各主要吸收峰歸屬：1 743 cm-1為2′-位酯C=O伸縮振動(dòng)峰；1 092 cm-1為酯C-O-C伸縮振動(dòng)峰；1 693 cm-1為C=N伸縮振動(dòng)峰；1 643 cm-1為N-H面內(nèi)彎曲振動(dòng)峰；1 249 cm-1為C-N伸縮振動(dòng)峰。

核磁共振各信號(hào)歸屬：δ=8.39（s， 1H）； 8.25（s， 1H）； 7.72（s， 2H）； 6.22（s， 1H）； 5.77-5.78（d， 1H）； 5.21-5.25（m， 1H）； 4.40-4.49（m， 1H）； 4.16-4.21（m， 1H）； 4.05-4.11（m， 1H）； 8.39（s， 1H）； 2.41-2.44（t， 2H）； 1.56-1.62（m， 2H）； 0.90-0.94（t， 3H）。共17個(gè)H，δ0.9-2.5為丁酰基相應(yīng)氫原子，δ4.0-6.3為呋喃糖相應(yīng)氫原子，δ7.0-8.5為腺嘌呤相應(yīng)H。其中δ=7.72處為N6-位氨基的兩個(gè)質(zhì)子，由于受共軛效應(yīng)影響顯著，化學(xué)位移向低場移動(dòng)。

3 討論

經(jīng)紫外全波長掃描二丁酰環(huán)磷腺苷鈣在272.5 nm處有最大吸收，選擇273 nm作為檢測波長。通過不同流動(dòng)相組合如甲酸系統(tǒng)、磷酸鹽緩沖系統(tǒng)等的篩選，發(fā)現(xiàn)緩沖鹽系統(tǒng)對(duì)產(chǎn)品的分析較好，考慮雜質(zhì)鑒定中采用質(zhì)譜的因素，選用揮發(fā)性甲酸銨和甲酸緩沖系統(tǒng)對(duì)樣品進(jìn)行分析。并通過不同pH條件下分離度的考察，發(fā)現(xiàn)樣品在pH 3.0時(shí)有較好的分離度，理論塔板數(shù)和拖尾因子等均較好。在二丁酰環(huán)磷腺苷鈣粗品中存在強(qiáng)疏水性的物質(zhì)，選用甲醇無法將其完全洗脫，故采用乙腈對(duì)其進(jìn)行洗脫，效果良好。

LC-MS技術(shù)，尤其是LC-MS/MS在化合物定性分析方面具有強(qiáng)專屬性和高靈敏度等特點(diǎn)[7-10]。在本文中采用該技術(shù)對(duì)二丁酰環(huán)磷腺苷鈣的最大單個(gè)雜質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)推斷，并用紅外光譜和核磁進(jìn)行確證。LC-MS/MS方法經(jīng)適當(dāng)優(yōu)化后還能對(duì)其他有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，但由于含量較低，不易獲得足夠樣品進(jìn)行紅外光譜和核磁檢測，按解析結(jié)構(gòu)合成樣品進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證或許能彌補(bǔ)該方法的不足。監(jiān)測工藝過程表明，2′-O-單丁酰環(huán)磷腺苷為二丁酰環(huán)磷腺苷鈣的水解產(chǎn)物。該工作為改進(jìn)工藝控制、減少有關(guān)物質(zhì)生成提供了研究基礎(chǔ)。

致謝：感謝霍建麗、耿敏對(duì)本文的貢獻(xiàn)。

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