李 琳，孫忠磊，崔艷麗

（1.哈藥集團(tuán)生物有限公司，哈爾濱 150069；2.黑龍江省獸藥飼料監(jiān)察所，哈爾濱 150070）

偽狂犬病病毒（PRV）屬于皰疹病毒科，水痘病毒屬。豬是該病毒唯一的自然宿主，病毒可以在豬體內(nèi)建立潛伏感染[1-3]。自從20世紀(jì)80年代開(kāi)始，很多國(guó)家通過(guò)使用滅活疫苗或經(jīng)傳代致弱的活疫苗去控制該??；在重要的家畜病毒性傳染病中，偽狂犬病的防控被認(rèn)為是使用高效滅活和弱毒活疫苗的成功藍(lán)本，不過(guò)活疫苗一般要比滅活疫苗更有效，特別是在活疫苗含有很高的病毒滴度和佐劑時(shí)更顯著；活疫苗在豬體內(nèi)沒(méi)有或只有很低的毒力，并能夠在豬體內(nèi)穩(wěn)定傳代[4]。本文綜述偽狂犬病活疫苗及在豬生產(chǎn)中的應(yīng)用。

1 偽狂犬病毒疫苗

1.1 經(jīng)典的偽狂犬病毒致弱活疫苗

第一個(gè)被致弱并用來(lái)作為活疫苗的是Bartha株。該毒株是通過(guò)在長(zhǎng)有大小不一的高毒力病毒蝕斑的細(xì)胞培養(yǎng)物中篩選穩(wěn)定的形成小蝕斑的突變株，自此成為了PRV疫苗中的經(jīng)典之作。另一個(gè)致弱疫苗叫做BUK，其來(lái)自高致病性的毒株Bucharest（BUK），在體外連續(xù)傳代獲得；BUK的衍生株是Norden株，也被廣泛應(yīng)用為弱毒活疫苗。隨后MK-2以及被進(jìn)一步弱化為It-21/07、Alfort26株、NIA-4等致弱的毒株，陸續(xù)被人熟知。

1.2 人工改造的PRV活疫苗

隨著基因工程時(shí)代的到來(lái)以及對(duì)PRV蛋白特性和功能認(rèn)知的不斷加深，新的基因改造活疫苗被研發(fā)出來(lái)。其中，編碼TK的基因被第一個(gè)作為靶標(biāo)用于失活，TK缺失的病毒株也是第一個(gè)獲得批準(zhǔn)使用的基因工程活疫苗。另一個(gè)作為靶標(biāo)的基因是gE，由Quint在1987年對(duì)NIA3毒株進(jìn)行缺失，gE缺失疫苗最終在世界范圍內(nèi)廣為流行。雙缺失gE和TK的突變株以及一些基于當(dāng)前PRV變異株的疫苗候選株也隨后被研發(fā)出來(lái)并且也得到了廣泛應(yīng)用，見(jiàn)附表。

附表 基因工程改造PRV活疫苗候選株

1.3 鑒別疫苗和野毒感染的策略（DIVA）在PRV防控上的使用

如果疫苗誘導(dǎo)免疫反應(yīng)與感染免疫不能互相區(qū)分，則在病原清除期間與清除后在血清學(xué)檢測(cè)中會(huì)較復(fù)雜。偽狂犬病就是將ELISA檢測(cè)應(yīng)用到DIVA策略的最早例子，廣泛使用的血清學(xué)檢測(cè)方法是gB/gE-ELISAs，該方法有很高的特異性和靈敏性，能夠檢測(cè)血清、血液或者初乳等樣品里的抗體。

2 偽狂犬病毒疫苗的應(yīng)用

2.1 可以作為表達(dá)外源抗原的載體

偽狂犬病毒基因組上有很多的插入位點(diǎn)允許外源基因的整合和表達(dá)，偽狂犬病毒就成為一個(gè)可以表達(dá)外源蛋白的工具，這樣的重組病毒作為疫苗能夠用于防治多種動(dòng)物傳染病。實(shí)際上PRV早已經(jīng)被用來(lái)作為載體插入和表達(dá)來(lái)自寄生蟲(chóng)、細(xì)菌和病毒的基因。很多重要?jiǎng)游锊《镜幕蛞呀?jīng)插入到PRV基因組中得到重組病毒，比如經(jīng)典豬瘟、豬流感和口蹄疫，而且口蹄疫PRV重組病毒中還額外插入了豬細(xì)小病毒的基因。

2.2 其他的骨架也可以作為疫苗候選者

雖然PRV自身可以作為表達(dá)外源抗原的有效載體，PRV的基因也可以插入到其他病毒載體中。譬如腺病毒及桿狀病毒，已經(jīng)被廣泛使用于表達(dá)重組蛋白來(lái)作為疫苗。而且PRV的蛋白也被插入到過(guò)豬痘病毒和ORF病毒基因組上形成重組病毒來(lái)進(jìn)行表達(dá)。另外CRISPR/Cas9系統(tǒng)的發(fā)明徹底改革了基因工程方法，已經(jīng)被用來(lái)研發(fā)PRV重組疫苗。

2.3 DNA免疫

PRV的糖蛋白能夠誘導(dǎo)很強(qiáng)的免疫反應(yīng)。因此Gerdt等在1997年將PRV編碼糖蛋白的基因插入到表達(dá)質(zhì)粒，制備了針對(duì)PRV的DNA疫苗。DNA疫苗有很多優(yōu)點(diǎn)：方便構(gòu)建且可以標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)質(zhì)粒，不必操作感染性病毒粒子，能誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，繞開(kāi)了來(lái)自母源的免疫力。相關(guān)報(bào)道也已經(jīng)證明針對(duì)偽狂犬病的DNA疫苗是非常有效的。然而，這些疫苗迄今還沒(méi)有商品化。

2.4 可替代路徑

研究表明，對(duì)豬群滴鼻免疫gE缺失疫苗可以產(chǎn)生更好的免疫力，現(xiàn)在通過(guò)皮下接種疫苗能夠刺激表皮的抗原遞呈細(xì)胞[5]。研究表明，1次皮下免疫PRV糖蛋白就能觸發(fā)家豬皮膚的先天免疫并能提供呼吸道保護(hù)性免疫。口腔免疫PRV弱毒活疫苗也被測(cè)試，并表明能為家豬和野豬提供對(duì)抗野毒株感染的保護(hù)力[6]。還有研究表明，gE缺失的PRV疫苗可以給小豬喂食提供免疫力，而且是安全的[7]。

3 小 結(jié)

疫苗只有作為動(dòng)物疫病綜合防控策略的一部分才是成功的。雖然基因改造的PRV活疫苗在商業(yè)化疫苗中被廣泛使用，但是沒(méi)有一個(gè)PRV載體疫苗獲得臨床應(yīng)用或商業(yè)化。原因是現(xiàn)有的疫苗已經(jīng)證明是有效的安全的，不必使用高科技的產(chǎn)品替代；而且一個(gè)好的疫苗需要有很高的病毒滴度，這一先決條件重組病毒往往不能滿(mǎn)足；另外在一個(gè)種群中比如野豬本身就有針對(duì)PRV的免疫力，這也限制了PRV作為病毒骨架的應(yīng)用。另一個(gè)需要考慮的因素是PRV作為骨架對(duì)在非豬科動(dòng)物的殘余毒力，特別是肉食動(dòng)物。而擁有最大程度弱化的PRV骨架，例如TK/gE缺失毒株則可以作為CSFV/PRV重組疫苗。

隨著我國(guó)偽狂犬病的反彈和流行，其疫苗研究再次成為熱點(diǎn)，盡管有這么多挑戰(zhàn)，現(xiàn)代的PRV載體疫苗為促進(jìn)預(yù)防性疫苗藥物的發(fā)展提供了新的視野。比如為解決細(xì)菌耐藥問(wèn)題，利用PRV載體疫苗作為對(duì)抗細(xì)菌感染的備選策略以減少抗生素的使用將是一條非常有前景的道路。

[1] An T Q,Peng J M,Tian Z J,et al.Pseudorabies virus variant in Bartha-K61-vaccinated pigs,China,2012[J].Emerging Infectious Diseases,2013,19（11）:1 749-1 755.

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[3] Dong B,Zarlenga D S,Ren X.An overview of live attenuated recombinant pseudorabies viruses for use as novel vaccines[J].Journal of Immunology Research,2014（1）:824 630.

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[6] Lei J L,Xia S L,Wang Y,et al.Safety and immunogenicity of a gE/gI/TK gene-deleted pseudorabies virus variant expressing the E2 protein of classical swine fever virus in pigs[J].Immunology Letters,2016,174:63-71.

[7] Maresch C,Lange E,Teifke J P,et al.Oral immunization of wild boar and domestic pigs with attenuated live vaccine protects against Pseudorabies virus infection[J].Veterinary Microbiology,2012,161（1-2）:20-25.