盧勁曄,趙懷寶,顧蓓蓓,馮 晴,張 磊,許 君,沈贊明*
(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,江蘇 南京 210095;2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院,江蘇 泰州 225300;3.連云港東海縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所,江蘇 連云港 222300)
反芻動物的胃是復(fù)胃,由4個胃室組成,分別是瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃和皺胃。其中,瘤胃與瓣胃為反芻動物主要的消化吸收場所。日糧添加精料比率對反芻動物前胃的生長發(fā)育起到重要的作用。在山羊與牛的研究中發(fā)現(xiàn),與單純飼喂粗料日糧相比,添加精料飼喂可以提高瘤胃重量,促進(jìn)瘤胃乳頭發(fā)育,增大瘤胃乳頭橫切面積[1-3]。大多數(shù)研究主要集中在瘤胃,研究表明高精料日糧提高瘤胃VFA含量,促進(jìn)瘤胃上皮生長發(fā)育。然而,關(guān)于日糧營養(yǎng)對瓣胃生長影響的研究較少。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn),提高精料飼喂比率后,瘤胃重量提高,而瓣胃重量下降[4]。本試驗(yàn)擬進(jìn)一步探索不同精粗比日糧引起山羊瘤胃、瓣胃上皮生長差異的機(jī)理。
本試驗(yàn)動物選用健康的青年波雜山羊(90~120日齡)16只。試驗(yàn)開始前適應(yīng)2周時間,期間對山羊進(jìn)行驅(qū)蟲,山羊自由采食及飲水,逐漸增加精料飼喂量至400 g·d-1。試驗(yàn)開始后,根據(jù)體重相近及公母對半原則,隨機(jī)分為粗料組(PS組,n=8)和粗料+精料組(PSC組,n=8)。試驗(yàn)期間自由飲水及采食花生桿;PSC組每天飼喂精料400 g,飼喂持續(xù)42 d,第43天屠宰取樣,日糧營養(yǎng)水平見表1。
表1 日糧營養(yǎng)水平 DM
山羊屠宰后取瘤胃、瓣胃上皮,用預(yù)冷的PBS(pH 7.4)反復(fù)沖洗,再用吸水紙擦干,部分樣品用10%福爾馬林溶液固定,部分樣品置于液氮保存。
1.3.1 上皮組織切片制作
采用石蠟切片法觀察瘤胃與瓣胃上皮組織形態(tài)。10%福爾馬林溶液固定24 h后,采用梯度酒精脫水,再將組織投入二甲苯中透明10~15 min,60℃石蠟包埋。冷卻后的蠟塊經(jīng)修塊后再用切片機(jī)切片,切片厚度5 μm。采用H.E染色法染色。
1.3.2 上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析
每只山羊的瘤胃及瓣胃樣品均取3個蠟塊,每個蠟塊精選3張非連續(xù)切片,每張切片分別讀取3個不同區(qū)域,再取平均值。采用Image-Pro Plus 8.0分析系統(tǒng)讀數(shù)上皮細(xì)胞層數(shù)。
1.4.1 上皮細(xì)胞的分離與固定
取出山羊瘤胃及瓣胃上皮組織,清洗干凈后,剪取組織塊(約500 mg)置于燒杯中,D-Hanks溶液漂洗3~4次;再加入胰酶37℃水浴消化;30 min后棄去上清液,再取出上皮組織。重復(fù)上述消化步驟3~4次。將處理后的上皮組織置于另1個干凈燒杯中,繼續(xù)加入胰酶消化10~15 min,顯微鏡鏡下觀察所得細(xì)胞大部分為圓形時進(jìn)行收集,收集液中加入1滴小牛血清以終止消化。收集液1 500 r·min-1離心10 min后得細(xì)胞沉淀,再用PBS洗滌細(xì)胞沉淀,加入2 mL預(yù)冷的75%酒精重懸細(xì)胞,混勻后4℃保存待測。
1.4.2 碘化丙啶染色與流式細(xì)胞分析
將75%酒精固定的上皮細(xì)胞1 500 r·min-1離心10 min。細(xì)胞沉淀用PBS 50 μL重懸,再加入碘化丙啶染液500 μL,震蕩混勻后置于室溫避光染色20 min,再用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。每個樣品計(jì)數(shù)10 000~12 000個細(xì)胞,用ModFit軟件分析結(jié)果。
山羊瘤胃與瓣胃重量見表2。
由表2可知,PSC組山羊瘤胃干重顯著高于PS組(P<0.05);相反,PSC組瓣胃干重顯著低于PS組(P<0.05)。結(jié)果表明添加精料飼喂促進(jìn)山羊瘤胃生長,卻抑制瓣胃生長。
表2 不同精粗比日糧對山羊瘤胃、瓣胃重量的影響
瘤胃上皮組織形態(tài)學(xué)變化如圖1所示。從黏膜面向漿膜面分為角質(zhì)層(SC)、顆粒層(SG)、棘突層(SS)和基底層(SB)。角質(zhì)層由多層角質(zhì)化細(xì)胞構(gòu)成,細(xì)胞呈扁平狀,細(xì)胞核及細(xì)胞器完全退化,細(xì)胞染色較深;顆粒層細(xì)胞細(xì)胞呈梭形,細(xì)胞核呈橢圓形,染色較淺;棘突層細(xì)胞較大,細(xì)胞核呈圓形;基底層又稱為生發(fā)層,由1~2層立方形細(xì)胞排列而成,細(xì)胞體積較小,排列整齊,細(xì)胞核染色較深。瓣胃上皮細(xì)胞組成及形態(tài)與瘤胃相似,見圖2。
日糧粗精比例對山羊瘤胃、瓣胃上皮細(xì)胞層數(shù)的影響見表3。
由表3可知,與PS組相比,PSC組山羊瘤胃上皮顆粒層和棘突層細(xì)胞總層數(shù)顯著升高,而PSC組瓣胃上皮顆粒層和棘突層細(xì)胞總層數(shù)顯著降低(P<0.05)。結(jié)果表明,添加精料飼喂促進(jìn)增加瘤胃上皮細(xì)胞層數(shù),卻減少瓣胃上皮細(xì)胞層數(shù)。
日糧粗精比例對山羊瘤胃、瓣胃上皮細(xì)胞周期的影響見表4。
由表4可知,PSC組山羊瘤胃上皮細(xì)胞S期和G2/M期細(xì)胞百分率均顯著高于PS組(P<0.05);而PSC組山羊瓣胃上皮細(xì)胞S期和G2/M期細(xì)胞百分率均顯著低于PS組(P<0.05)。結(jié)果表明,添加精料飼喂加速瘤胃上皮細(xì)胞周期G1期進(jìn)程,促進(jìn)細(xì)胞增殖,而添加精料比率卻抑制瓣胃增殖。
圖1 瘤胃上皮乳頭切片
圖2 瓣胃上皮組織切片
表3 日糧粗精比例對山羊瘤胃、瓣胃上皮細(xì)胞層數(shù)的影響
表4 日糧粗/精比例對山羊瘤胃、瓣胃上皮細(xì)胞周期的影響 %
研究發(fā)現(xiàn)日糧添加精料加速瘤胃上皮細(xì)胞增殖,促進(jìn)瘤胃上皮細(xì)胞生長。早在20世紀(jì)50年代,就有研究報道了日糧添加精料增大犢牛瘤胃體積,促進(jìn)瘤胃乳頭發(fā)育[5]。后續(xù)研究表明日糧添加精料促進(jìn)青年奶牛瘤胃乳頭生長,此結(jié)果是由飼料的高能量水平而并非飼料物理性狀引起的[6]。但這些試驗(yàn)僅限于高能量日糧促進(jìn)瘤胃上皮乳頭增大的表觀指標(biāo),而不清楚其機(jī)理。
本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),日糧添加精料促進(jìn)瘤胃上皮生長是通過縮短瘤胃上皮細(xì)胞周期進(jìn)程,減速細(xì)胞增殖實(shí)現(xiàn)的。本試驗(yàn)中,瓣胃上皮結(jié)果與瘤胃相反,純粗料日糧加速瓣胃上皮細(xì)胞增殖,促進(jìn)瓣胃上皮細(xì)胞生長。此結(jié)果與在鼠結(jié)腸的一項(xiàng)研究結(jié)果類似,日糧添加纖維素比率可以降低降低G0/G1期細(xì)胞比率、提高S期細(xì)胞比率,促進(jìn)細(xì)胞增殖[7]。不同精粗比率日糧對瘤胃、瓣胃上皮生長的差異性可能與瘤胃、瓣胃結(jié)構(gòu)及功能的差異相關(guān)。
瘤胃中日糧的消化主要由微生物完成,瘤胃內(nèi)微生物將食物發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸后被瘤胃上皮吸收;瓣胃的主要表現(xiàn)為“篩網(wǎng)”作用,通過瓣胃肌肉的劇烈收縮將大顆粒食物研磨成細(xì)小的顆粒;因而瓣胃上皮的發(fā)育可能對進(jìn)入瓣胃食物的物理性狀依賴性較強(qiáng),但其具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究加以證明。
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