李洪艷，鞏福麗

（哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司，哈爾濱 150069）

目前，豬偽狂犬病病毒滅活疫苗的生產(chǎn)主要是轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞培養(yǎng)的傳統(tǒng)培養(yǎng)方式，進(jìn)而增殖豬偽狂犬病病毒[1-2]。但轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)細(xì)胞增殖較緩慢且生產(chǎn)過程中對細(xì)胞和病毒培養(yǎng)條件，如pH、溶氧、糖耗等難以監(jiān)控和適時補(bǔ)給，無法提供最佳的培養(yǎng)條件，造成該方法自動化程度低、勞動強(qiáng)度大，并因?yàn)檗D(zhuǎn)瓶細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的不可控性，導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性不夠，批間差較大。另外提高病毒毒價，保證良好的臨床效果是解決豬偽狂犬病病毒滅活疫苗產(chǎn)業(yè)化的當(dāng)務(wù)之急。而用生物反應(yīng)器替代轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)疫苗株則克服了上述不足，成為前景最好的豬偽狂犬病病毒滅活疫苗生產(chǎn)技術(shù)之一[3-5]。

1 材料與方法

生物反應(yīng)器：美國Wave Biotech公司W(wǎng)AVE波浪生物反應(yīng)器；微載體：Cytodex-1（美國通用電氣醫(yī)療集團(tuán)生命科學(xué)部）；豬偽狂犬病病毒：購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1 細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)

用方瓶培養(yǎng)從液氮罐中復(fù)蘇的ST細(xì)胞，培養(yǎng)條件為：pH 7.2，溫度37℃，培養(yǎng)48～72 h，形成良好細(xì)胞單層時，用于繼續(xù)傳代或接種于生物反應(yīng)器中進(jìn)行微載體懸浮培養(yǎng)。該過程中使用的培養(yǎng)基為MEM，血清為胎牛血清，使用量為8%。

1.2 微載體處理

按培養(yǎng)的終體積稱取微載體適量，用無Ca2+、Mg2+-PBS室溫浸泡過夜，棄去PBS，再用無Ca2+、Mg2+-PBS洗1次，棄去，最后加入無Ca2+、Mg2+-PBS高壓滅菌。115℃、10 psi、15 min。

1.3 微載體培養(yǎng)

用EDTA-胰酶細(xì)胞消化液制備細(xì)胞懸液，細(xì)胞計數(shù)后按2×105個·mL-1的密度接種到細(xì)胞培養(yǎng)袋中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)的方法參數(shù)為：微載體濃度為2 g·L-1、DO值50%、溫度37℃、擺動角度7°擺動速度16 r·min-1。在培養(yǎng)過程中監(jiān)控細(xì)胞培養(yǎng)袋中葡萄糖的消耗以及乳酸和氨的產(chǎn)生，同時在不同的節(jié)點(diǎn)上細(xì)胞計數(shù)（Cytodex1上的細(xì)胞計數(shù)先用PBS漂洗2次，經(jīng)0.1%結(jié)晶紫的檸檬酸溶液染色，用血球計數(shù)板計數(shù)細(xì)胞核），當(dāng)細(xì)胞的密度達(dá)到1×106～2×106個·mL-1時開始灌注，依據(jù)細(xì)胞的密度、葡萄糖的消耗以每天灌注0.7～2個工作體積的速度，以維持細(xì)胞的生成。

1.3.1 細(xì)胞接種密度的確定

當(dāng)微載體的用量為2 g·L-1，分別以5×104、1×105、2×105、3×105、4×105、5×105、6×105個·mL-1的接種密度接種ST細(xì)胞，每天取樣分析。不同接種密度細(xì)胞生長情況見表1。

表1 不同接種密度細(xì)胞生長情況 個·mL-1

由表1可知，當(dāng)微載體含量相等，不同的接種密度對ST細(xì)胞生長影響較大。以5×104、1×105個·mL-1接種時，接種后5 d仍在緩慢生長，沒有進(jìn)入穩(wěn)定生長期的明顯標(biāo)志；以2×105、3×105、4×105、5×105、6×105個·mL-1接種時，ST細(xì)胞在接種后第2 d進(jìn)入穩(wěn)定生長期；從表1的數(shù)據(jù)的可知，隨著細(xì)胞接種密度的增高，ST細(xì)胞生長速度的增加并不與細(xì)胞接種密度增加保持同步；當(dāng)ST細(xì)胞接種密度為2×105個·mL-1時，ST細(xì)胞在第4和5天后的生長速度要明顯高于其他接種密度的生長速度，因此，優(yōu)選采用2×105個·mL-1的接種量接種ST細(xì)胞。

1.3.2 微載體含量的確定

細(xì)胞接種密度與微載體含量對細(xì)胞生長的影響密切相關(guān)，其中重要的標(biāo)志是接種時要保證合適的細(xì)胞密度與載體的比例關(guān)系。

在每g微載體接種相同ST細(xì)胞數(shù)的前提下，考察Cytodex 1含量為1、2、3、4、5、6、7和8 g·L-1時ST細(xì)胞生長情況，用來確定合適的載體用量。不同微載體含量細(xì)胞生長情況見表2。

由表2可知，隨著微載體含量的增加，ST細(xì)胞密度會有所增加，但ST細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)有所降低。微載體含量為2 g·L-1時，ST細(xì)胞生長較快，培養(yǎng)時間為5 d時，ST細(xì)胞密度達(dá)到了1.68×107g·L-1，高于其他的微載體的細(xì)胞密度；此外，當(dāng)微載體含量＞2 g·L-1時，ST細(xì)胞生長的增加速度不顯著。因此，在細(xì)胞培養(yǎng)袋中培養(yǎng)ST細(xì)胞時，所加入的微載體的含量優(yōu)選為2 g·L-1。因此綜合考慮，本試驗(yàn)微載體含量采用2 g·L-1。

1.3.3 搖動條件的確定

以2 g·L-1的含量加入微載體，以2×105個·mL-1密度接種ST細(xì)胞，加入細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，擺動角度分別為5、6、7、8、9°；擺動速度分別為12、14、16和18 r·min-1，每d取樣，觀察微載體上細(xì)胞吸附和生長情況，考察搖動條件對細(xì)胞培養(yǎng)的影響。不同搖動條件下細(xì)胞生長情況見表3。

表2 不同微載體含量細(xì)胞生長情況 個·mL-1

表3 不同搖動條件下細(xì)胞生長情況 個·mL-1

由表3可知，整個培養(yǎng)過程，搖動條件對細(xì)胞的密度影響較大。結(jié)果表明，當(dāng)搖動條件為擺動角度7°、擺動速度16 r·min-1時，在此搖動條件下細(xì)胞的生長速度要遠(yuǎn)高于其他的搖動條件。因此，搖動條件優(yōu)選為擺動角度7°、擺動速度16 r·min-1。

1.4 病毒液的增殖

當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)到達(dá)第4天時沉降微載體，排出細(xì)胞培養(yǎng)袋中液體，加入PBS洗滌細(xì)胞，重復(fù)洗滌3次，加入病毒維持液并接種豬偽狂犬病病毒，其中病毒接種劑量為3%、病毒增殖的培養(yǎng)基為含1%血清的MEM，pH 7.4，溫度35℃。接毒后每隔一定時間取生物反應(yīng)器中的微載體，用顯微鏡觀察細(xì)胞病變情況，并檢測樣品TCID50，當(dāng)微載體上的細(xì)胞大部分脫落，停止培養(yǎng)，收獲病毒液，于-20℃凍融兩次，得到豬偽狂犬病病毒液。

1.4.1 病毒含量的測定

利用TCID50方法進(jìn)行病毒含量的測定。病毒TCID50測定時，以MEM培養(yǎng)液將培養(yǎng)得到的豬偽狂犬病毒液作連續(xù)10倍稀釋，即10-1、10-2……10-8，每個稀釋度取100 μL加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的孔中，隨后加入經(jīng)胰蛋白酶-EDTA消化分散的ST細(xì)胞懸液，每孔100 μL（細(xì)胞含量約3×105·mL-1為宜），每個稀釋度作8個重復(fù)，并設(shè)正常細(xì)胞培養(yǎng)對照，置5%CO2培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)，逐日觀察細(xì)胞病變和對照，共觀察2～4 d，并記錄細(xì)胞病變的孔數(shù)，Reed-Muench法計算病毒的TCID50。同時以相同的方法對用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的豬偽狂犬病毒液進(jìn)行TCID50測定。以此作為對照組。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 豬偽狂犬病病毒病毒含量

豬偽狂犬病病毒病毒含量見表4。

由表4可知，利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)的豬偽狂犬病毒液病毒含量不小于轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的豬偽狂犬病毒液病毒含量。由此可見利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)的病毒要明顯優(yōu)于轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的病毒。

2.2 病毒維持液血清濃度的確定

分別選擇0.5%、1%、1.5%、2%血清濃度維持液，培養(yǎng)結(jié)束后，分別對含毒細(xì)胞培養(yǎng)液的病毒含量進(jìn)行測定，以確定最佳血清濃度的維持液。不同血清濃度維持液對病毒增值的影響見表5。

表4 豬偽狂犬病病毒含量

表5 不同血清濃度維持液對病毒增殖的影響

由表5可知，血清濃度對病毒的增值有一定影響，當(dāng)血清濃度為1%時，病毒含量為107.6TCID50/0.1 mL，明顯高于血清濃度為0.5%時的病毒含量。因此選擇血清濃度為1%的維持液培養(yǎng)病毒。

2.3 病毒液滅活及乳化制成疫苗

收獲病毒液用二乙烯亞胺（BEI）滅活，BEI終濃度0.03%，30℃滅活72 h。滅活后的豬偽狂犬病毒液加入常規(guī)油性佐劑，攪拌混勻，制得油乳劑疫苗。

2.4 疫苗的安全性試驗(yàn)

試制3批疫苗，接種約18 g小白鼠10只，接種0.3 mL·只-1，觀察14 d；接種初生仔豬、斷奶仔豬及妊娠母豬，2 mL·頭-1，超劑量接種10 mL·頭-1，接種后未見對生殖功能有任何影響，體溫、進(jìn)食、配種、妊娠、產(chǎn)仔均正常。試驗(yàn)結(jié)果表明，滅活疫苗安全性良好。

2.5 疫苗免疫原性比較

取豬偽狂犬病毒血清中和抗體陰性的斷奶仔豬30頭，分為3組，10頭·組-1，組1免疫接種試制豬偽狂犬病滅活疫苗，肌肉注射，3 mL·頭-1；組2免疫接種傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶制備的豬偽狂犬病滅活疫苗，肌肉注射，3 mL·頭-1。組3為非免疫對照。接種疫苗后觀察6個月，分別于接種疫苗后的7、14、21、30、90、120、150及180 d，采血，測定血清中豬偽狂犬病毒中和指數(shù)，比較兩種疫苗的抗體消長規(guī)律及免疫持續(xù)時間。接種疫苗后豬偽狂犬病毒血清抗體中和指數(shù)測定結(jié)果見表6。

表6 接種疫苗后豬偽狂犬病毒血清抗體中和指數(shù)測定結(jié)果

免疫接種6個月后，3個試驗(yàn)組均用相同劑量的豬偽狂犬病病毒強(qiáng)毒株攻擊，滅活疫苗對豬偽狂犬病病毒強(qiáng)毒攻擊的免疫保護(hù)力見表7。

由表7可知，反應(yīng)器苗免疫豬血清中和抗體于免疫后14 d＞316，于30 d＞1 000，之后抗體水平開始下降，于180 d進(jìn)行強(qiáng)毒攻擊，保護(hù)率為100%；轉(zhuǎn)瓶苗免疫豬血清中和抗體于免疫后21 d＞316，于30 d＜1 000，于180 d進(jìn)行強(qiáng)毒攻擊，保護(hù)率為80%，由此可以得出，反應(yīng)器所制備的滅活疫苗對于豬有良好的免疫保護(hù)效果，且免疫保護(hù)效力要顯著優(yōu)于傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶制備的滅活疫苗對豬的免疫保護(hù)效力。

表7 滅活疫苗對豬偽狂犬病病毒強(qiáng)毒攻擊的保護(hù)力

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