姜曉亮，劉 雪，劉云鵬，付 慧，劉 星，楊志偉(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，北京 100021)

吸煙是嚴(yán)重危害公共健康的重大問題，也是導(dǎo)致支氣管肺癌和慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)等疾病發(fā)展的重要病因之一[1]。香煙煙霧(cigarette smoke，CS)含有多種復(fù)雜的化學(xué)物質(zhì)，包括大量的自由基以及高濃度的氧化劑[2]。香煙煙霧中自由基的吸入可導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)，直接損傷肺泡上皮細(xì)胞，是誘發(fā)肺損傷的第一步[3]。肺泡II型上皮細(xì)胞(alveolar type II epithelial cells，AT-II)是肺泡上皮的干細(xì)胞[4]，它的損傷參與了多種慢性氣道疾病的發(fā)展，導(dǎo)致不良預(yù)后的發(fā)生[5 - 6]。因此，保護(hù)AT-II細(xì)胞免受香煙煙霧的傷害，在多種與吸煙相關(guān)肺病的治療中有重要意義。

Sestrin2是抗氧化蛋白Sestrin家族的重要成員[7]，它可緩解糖尿病代謝異常、心血管疾病等導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷[8 - 9]，近年來被認(rèn)為是一種高效的安全生物制劑。Sestrin2通過抑制過氧化物酶(Prx-SO2/3H)的超氧化，降低細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平[10]，從而發(fā)揮抗氧化作用，可能參與吸煙誘導(dǎo)的AT-II細(xì)胞損傷的發(fā)生發(fā)展，然而肺泡上皮細(xì)胞受到煙霧刺激損傷時(shí)Sestrin2的作用機(jī)制仍然不是很清楚。因此，該研究以肺泡II型上皮細(xì)胞為靶細(xì)胞，從而對(duì)Sestrin2在香煙煙霧誘導(dǎo)的AT-II細(xì)胞損傷中的作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人A549細(xì)胞株(肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞來源)購自美國培養(yǎng)物保存中心(ATCC，編號(hào)：CRM-CCL-185)。

1.2 主要試劑與儀器

1640培養(yǎng)基購于Gibco公司；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和雙抗以及Lipofectamine TM2000購自Invitrogen公司；Sestrin2抗體、GAPDH抗體購自Cell Signaling Technology公司；peroxiredoxin-Cys和peroxiredoxin-SO3抗體購自Abcam公司；Sestrin2 siRNA和non-silencing siRNA購自Thermo Scientific公司；2’, 7’-二氯熒光素二乙酸酯(2’, 7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFDA)購自Molecular Probes公司；羰酰氰基對(duì)氯苯脘購自Sigma公司；山羊抗兔/鼠二抗購自北京中山金橋公司；TNF-α和IL-8檢測(cè)ELISA試劑盒購自上海信帆生物有限公司。電泳儀(北京六一儀器廠，DYY-C)；電泳槽(上海天能，VE-180)；電轉(zhuǎn)槽(上海天能，VE-186)；多功能酶標(biāo)儀(Multiskan GO)；化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀(Tanon-5500)；正向顯微鏡(Leica DM6000 B)；低溫高速離心機(jī)(Beckman)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組

將A549細(xì)胞用含10% FBS的1640培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于相應(yīng)的培養(yǎng)皿中長(zhǎng)至約70%～80%，實(shí)驗(yàn)前需換無血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)2～4 h然后用于實(shí)驗(yàn)。然后將A549細(xì)胞分為八組：對(duì)照組、香煙煙霧提取物(cigarette smoke extract，CSE)處理組(10%，24 h)、阿奇霉素(azithromycin，AZM)處理組(5 μg/mL，24 h)、CSE +阿奇霉素處理組、轉(zhuǎn)染non-silencing siRNA組(10 nmol/L，48 h)、轉(zhuǎn)染Sestrin2 siRNA組(10 nmol/L，48 h)、轉(zhuǎn)染non-silencing siRNA +阿奇霉素處理組和轉(zhuǎn)染Sestrin2 siRNA +阿奇霉素處理組。

1.3.2 香煙煙霧提取物(CSE)的制備

參照Carp等[11]的方法，將兩支香煙去掉濾嘴后燃燒，由50 mL注射器負(fù)壓吸引裝置(改造)連續(xù)勻速抽吸(50 mL/min)，該裝置將煙霧吸入10 mL的1640培養(yǎng)基中，香煙在15 min內(nèi)需要燃燒完畢，然后充分搖動(dòng)使其溶解制成懸液，并用1 mol/L氫氧化鈉(NaOH)將pH調(diào)至7.2～7.4，最后用0.22 μm孔徑的濾器(Millipore，Watford，UK)過濾，除去細(xì)菌和雜質(zhì)。制備好的CSE原液用不含血清的1640培養(yǎng)基稀釋10倍[12]，濃度用百分?jǐn)?shù)表示(10%)，在30 min內(nèi)用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 A549細(xì)胞Sestrin2基因沉默

A549細(xì)胞在6孔培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h，細(xì)胞密度達(dá)到每孔2 × 105個(gè)。按照說明書的步驟，使用Lipofectamine TM2000將Sestrin2 siRNA(10 nmol/L)轉(zhuǎn)入到A549細(xì)胞中，non-silencing siRNA作為陰性對(duì)照。轉(zhuǎn)染48 h后更換新鮮的培養(yǎng)基(含10% FBS)，用免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞中Sestrin2的表達(dá)。

注：與對(duì)照組相比，# P< 0.05；與未進(jìn)行阿奇霉素處理的香煙煙霧提取物組相比，* P< 0.05。圖1 香煙煙霧提取物對(duì)肺泡上皮細(xì)胞ROS和細(xì)胞因子的影響Note.Compared with the control group,#P< 0.05. Compared with the CSE group without AZM treatment, *P< 0.05.Fig.1 Effects of cigarette smoke extract on ROS production and the secretion of cytokines in the pulmonary alveolar epithelial A549 cells

1.3.4 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

用細(xì)胞刮收集各組處理后的細(xì)胞，放置到蛋白裂解液中制備總蛋白樣本，BCA法測(cè)蛋白濃度并調(diào)整一致。每個(gè)樣本取30 μg上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉常溫封閉1 h，抗體稀釋液將不同抗體按比例稀釋：抗Sestrin2(1∶500)、peroxiredoxin-Cys(1∶1000)、peroxiredoxin-SO3(1∶200)和GAPDH一抗，放置于4℃冰箱孵育過夜，再次洗膜，室溫下孵育二抗(1∶5000，1 h)，洗膜后使用化學(xué)發(fā)光試劑顯色，NC膜掃描保存并定量分析。

1.3.5 炎癥因子水平檢測(cè)

取實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞上清液，ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞上清液TNF-α和IL-8的水平，所有實(shí)驗(yàn)操作均嚴(yán)格按照ELISA試劑盒使用說明書進(jìn)行，并設(shè)定實(shí)驗(yàn)平行組，最終使用酶標(biāo)儀讀數(shù)并分析。

1.3.6 細(xì)胞內(nèi)ROS水平檢測(cè)

細(xì)胞內(nèi)ROS水平采用DCFDA熒光探針進(jìn)行檢測(cè)。藥物處理的細(xì)胞使用無血清的1640培養(yǎng)基洗1次后，加入10 μmol/L DCFDA于37℃孵育30 min，羰酰氰基對(duì)氯苯脘作陽性對(duì)照。使用微板閱讀器在485 nm的激發(fā)波長(zhǎng)和530 nm的發(fā)射波長(zhǎng)上測(cè)量DCFDA熒光并計(jì)算ROS的陽性率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 香煙煙霧提取物誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激

已有研究證實(shí)氧化應(yīng)激是香煙煙霧的主要致病因子[12]，本研究采用香煙煙霧提取物(CSE，10%)處理肺泡上皮細(xì)胞24 h。研究發(fā)現(xiàn)CSE組細(xì)胞ROS產(chǎn)量較對(duì)照組顯著升高(P< 0.05，圖1A)，細(xì)胞分泌的TNF-α和IL-8顯著增多(P< 0.05，圖1B和1C)。研究證實(shí)在A549細(xì)胞中，阿奇霉素能夠抑制CSE誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷[13]，因此本研究在CSE處理的基礎(chǔ)上同時(shí)給予阿奇霉素(AZM，5 μg/mL)。如圖1所示，AZM能夠顯著緩解CSE誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生，細(xì)胞分泌的TNF-α和IL-8等炎癥因子較未進(jìn)行阿奇霉素處理的CSE組亦顯著減少。

2.2 Sestrin2在肺泡上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激中的作用

圖2A顯示，CSE處理A549細(xì)胞后抗氧化蛋白Sestrin2的表達(dá)較對(duì)照組顯著降低[(71±7.2)%比(100±8.7)%，P< 0.05]，該結(jié)果顯示Sestrin2可能通過其抗氧化作用參與了吸煙誘導(dǎo)的COPD。為證實(shí)Sestrin2在COPD中的重要作用，本研究給予肺泡上皮細(xì)胞Sestrin2 siRNA(10 nmol/L)處理。48 h后檢測(cè)Sestrin2蛋白表達(dá)顯著降低[(50±8.9)%比(100±10)%，圖2B]。Sestrin2 siRNA沉默組細(xì)胞的ROS的產(chǎn)量較對(duì)照組顯著升高(P< 0.05，圖3 A)，炎癥因子TNF-α和IL-8的水平顯著增加(P< 0.05，圖3B和3C)。但給予Sestrin2 siRNA組阿奇霉素，發(fā)現(xiàn)升高的ROS并沒有顯著降低，Sestrin2 siRNA沉默后使得阿奇霉素的抗氧化作用效果減弱。該結(jié)果證實(shí)了Sestrin2在肺泡上皮細(xì)胞中重要的抗氧化作用，同時(shí)顯示阿奇霉素能夠直接或者間接通過Sestrin2發(fā)揮其抗氧化功能。

2.3 Sestrin2通過抑制Prx-SO2/3的超氧化參與肺泡上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的機(jī)制

Sestrin2能夠抑制過氧化物酶的超氧化從而抑制ROS的產(chǎn)生[10]。過氧化物酶是一種以硫?yàn)榛A(chǔ)的抗氧化酶，它通過兩對(duì)半胱氨酸的氧化(Prx-SO2/3)，導(dǎo)致過氧化物酶活性的失活[14]。為探索肺泡上皮細(xì)胞中Sestrin2對(duì)過氧化物酶的調(diào)節(jié)作用，本研究檢測(cè)了peroxiredoxin-SO3(Prx-SO2/3)和總peroxiredoxin-Cys(Prx-2Cys)蛋白的表達(dá)，計(jì)算二者的比率。如圖4 A所示，CSE處理A549細(xì)胞后Prx-SO2/3表達(dá)較對(duì)照組顯著增加[(232±8.1)%比(100±4.6)%，P< 0.05]而總Prx-2Cys不變，加入AZM能夠顯著減少CSE誘導(dǎo)的Prx-SO2/3超氧化[(171±13)%比(232±8.1)%，P< 0.05]。Sestrin2 siRNA同樣能夠誘導(dǎo)Prx-SO2/3超氧化[(156±9.1)%比(100±5.1)%，P< 0.05]，但Sestrin2 siRNA沉默后再給予AZM并不能減少Prx-SO2/3的超氧化[(148±7.9)%比(156±9.1)%，圖4B]。證實(shí)A549細(xì)胞中Sestrin2通過抑制Prx-SO2/3的超氧化，從而抑制過氧化物酶的失活以及ROS產(chǎn)生，可能成為COPD抗氧化治療的重要機(jī)制。

注：與對(duì)照組相比，# P< 0.05；與未進(jìn)行阿奇霉素處理的香煙煙霧提取物組相比，* P< 0.05；與未沉默組相比，& P< 0.05。圖2 Sestrin2在肺泡上皮細(xì)胞中的表達(dá)Note.Compared with the control group,#P< 0.05. Compared with the CSE group without AZM treatment, *P< 0.05. Compared with the non-silencing siRNA group, &P< 0.05.Fig.2 Expression of Sestrin2 in the pulmonary alveolar epithelial A549 cells

注：與未沉默組相比，& P< 0.05。圖3 Sestrin2 siRNA對(duì)肺泡上皮細(xì)胞ROS和細(xì)胞因子的影響Note.Compared with the non-silencing siRNA group, &P< 0.05.Fig.3 Effects of Sestrin2 siRNA on ROS production and secretion of cytokines in the pulmonary alveolar epithelial A549 cells

注：與對(duì)照組相比，# P< 0.05；與未進(jìn)行阿奇霉素處理的香煙煙霧提取物組相比，* P< 0.05；與未進(jìn)行阿奇霉素處理的未沉默組相比，& P< 0.05。圖4 Prx-SO2/3和Prx-Cys在肺泡上皮細(xì)胞中的表達(dá)Note.Compared with the control group,#P< 0.05. Compare with the CSE group without AZM treatment, *P< 0.05. Compared with the non-silencing siRNA group without AZM treatment,&P< 0.05.Fig.4 Expression of Prx-SO2/3 and Prx-Cys in the pulmonary alveolar epithelial A549 cells

3 討論

吸煙是導(dǎo)致肺內(nèi)呼吸障礙的主要病因，包括慢性阻塞性肺疾病和特發(fā)性肺纖維化[15]，其特征是肺泡上皮細(xì)胞的不可逆損傷。香煙煙霧(CS)是活性氧的豐富來源，氧化應(yīng)激損傷是香煙煙霧的主要致病因子[12]。香煙煙霧的化學(xué)成分復(fù)雜，在本研究中，香煙煙霧提取物(CSE)被用于模擬香煙煙霧。在肺的各種細(xì)胞類型中，肺泡上皮細(xì)胞是氧化損傷的主要部位之一。與I型肺泡細(xì)胞(ATI)相比，肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(ATII)在肺內(nèi)的免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，它可以分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子對(duì)呼吸刺激引起的慢性阻塞性肺疾病等慢性肺病的發(fā)展起重要作用[16]。本實(shí)驗(yàn)選用的人A549細(xì)胞系來源于肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞，其脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體和補(bǔ)體系統(tǒng)與原代培養(yǎng)的ATII細(xì)胞具有顯著相似性，作為ATII細(xì)胞生理模型廣泛應(yīng)用[17]。通過給予A549細(xì)胞香煙煙霧提取物(CSE)干預(yù)，本研究發(fā)現(xiàn)抗氧化蛋白Sestrin2能夠抑制過氧化物酶Prx-SO2/3超氧化，從而阻斷肺泡細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的過度生成并抑制炎癥因子分泌增多，可能成為吸煙誘導(dǎo)肺泡II型上皮細(xì)胞損傷及吸煙相關(guān)肺病治療的新靶點(diǎn)。

Sestrins蛋白是一類保守的應(yīng)激誘導(dǎo)型抗氧化蛋白，在氧化應(yīng)激和DNA損傷時(shí)表達(dá)上調(diào)[9]。哺乳動(dòng)物的Sestrins家族成員主要包括：Sestrin1、Sestrin2和Sestrin3。Sestrin2是Sestrins家族中的重要成員，它是p53的轉(zhuǎn)錄調(diào)控底物分子[18]。Sestrin2能通過抑制細(xì)胞內(nèi)ROS生成而發(fā)揮抗氧化作用，對(duì)抗糖尿病代謝異常、心血管疾病等導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷，近年來被廣泛研究[8 - 9]。本研究證明在A549細(xì)胞中CSE可誘導(dǎo)Sestrin2表達(dá)抑制和ROS的大量生成，而同時(shí)給予阿奇霉素能夠有效緩解ROS的增多，并且使得Sestrin2表達(dá)增加。Barnes[19]在2013年提出了香煙煙霧通過氧化應(yīng)激誘導(dǎo)慢性阻塞性肺疾病的過程。文章指出ROS通過激活NF-κB和p38 MAPK，從而導(dǎo)致促炎、炎性細(xì)胞因子和趨化因子基因的激活，進(jìn)而加速肺損傷和慢性阻塞性肺疾病的發(fā)展[20]。TNF-α、IL-8是參與慢性氣道性疾病炎癥反應(yīng)的重要促炎因子[21]，通過誘發(fā)氣道、肺實(shí)質(zhì)以及肺部血管的慢性炎癥反應(yīng)最終導(dǎo)致肺結(jié)構(gòu)的破壞。因此本研究也檢測(cè)了Sestrin2對(duì)于炎癥因子TNF-α和IL-8水平的影響。發(fā)現(xiàn)給予A549細(xì)胞Sestrin2 siRNA之后ROS的生成增多，TNF-α和IL-8的水平顯著升高，但同時(shí)給予阿奇霉素?zé)o法降低ROS的生成，也不能緩解TNF-α和IL-8的升高，證實(shí)了抗氧化蛋白Sestrin2在肺泡II型上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷以及炎癥反應(yīng)中的重要作用。

研究表明Sestrin2可抑制過氧化物酶(Prx-SO2/3)的超氧化，清除細(xì)胞內(nèi)的H2O2從而維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原穩(wěn)態(tài)[22]。為探索Sestrin2的作用機(jī)制，本研究用Sestrin2 siRNA沉默處理A549細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Sestrin2 siRNA組細(xì)胞中超氧化的Prx-SO2/3增多而總蛋白Prx-2Cys表達(dá)不變。Yang等[10]發(fā)現(xiàn)在腎臟中Sestrin2能夠抑制過氧化物酶(Prx-SO2/3)的超氧化，并且激活PON2信號(hào)通路參與了多巴胺D2受體誘導(dǎo)的ROS生成的阻斷。Woo等[23]也指出抑制Prx-2Cys的超氧化和Sestrin2對(duì)氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)作用相似。本研究則證實(shí)在肺泡上皮細(xì)胞中Sestrin2通過抑制下游Prx-SO2/3的超氧化從而參與ROS的生成以及減少氧化應(yīng)激。另外本研究額外給予Sestrin2 siRNA組的細(xì)胞阿奇霉素處理，發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷并不能夠緩解。該結(jié)果再次證實(shí)了Sestrin2以及下游過氧化物酶在肺泡上皮細(xì)胞中的重要作用。Sestrin2也可通過多種機(jī)制參與ROS生成的調(diào)控，它通過下游信號(hào)通路在多種病理生理現(xiàn)象中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)Sestrin2能夠激活A(yù)MPK/mTORC1信號(hào)通路從而抑制ROS的生成并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，被認(rèn)為結(jié)腸直腸癌的新靶點(diǎn)[24]。在腎小球系膜細(xì)胞中Sestrin2能夠激活A(yù)MPK通路參與阻斷NOX4依賴的ROS生成[25]。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，選擇性降低Sestrin2的表達(dá)可激活下游mTORC1-S6K信號(hào)通路，從而導(dǎo)致胰島素抵抗、葡萄糖耐受不良并出現(xiàn)肥胖等一系列代謝病癥[26]。

綜上所述，Sestrin2能夠抑制過氧化物酶(Prx-SO2/3)的超氧化阻斷ROS的多度產(chǎn)生，在香煙煙霧誘導(dǎo)的肺泡II型上皮細(xì)胞損傷中起到重要的保護(hù)作用，可能為吸煙相關(guān)肺病的防治提供新思路。然而Sestrin2還能夠通過哪些信號(hào)途徑和相關(guān)機(jī)制來抑制香煙誘導(dǎo)的肺泡II型上皮細(xì)胞損傷目前尚不得知。此外是否有其他抗氧化或抗炎分子在這一過程中協(xié)同作用也不明確，還需要進(jìn)一步探索研究。

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