陳志軍，張大華(西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，西安 710077)

骨性關(guān)節(jié)炎是常見的退行性關(guān)節(jié)病變，主要病理改變?yōu)殛P(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行性變性破壞、邊緣骨贅形成和關(guān)節(jié)腔間隙狹窄，同時(shí)伴有不同程度的滑膜炎癥，臨床表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)疼痛和功能障礙，嚴(yán)重者可導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)畸形甚至殘疾[1]。目前西醫(yī)治療骨關(guān)節(jié)炎以激素、非甾體類抗炎藥、手術(shù)等為主，尚缺乏完全治愈的有效方法，聯(lián)合中醫(yī)藥治療可延緩關(guān)節(jié)炎的病理進(jìn)程，改善治療預(yù)后[2]。正清風(fēng)痛寧是從中藥清風(fēng)藤中提取的有效成分，主要藥用成分為鹽酸青藤堿，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)等多種作用，聯(lián)合非甾體類抗炎藥治療骨關(guān)節(jié)炎具有肯定療效，但其藥理研究多集中于抗炎消腫、抗T淋巴細(xì)胞增殖等方面，其藥理作用尚有待進(jìn)一步研究探討[3 - 4]。研究[5]顯示，骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨退化的主要病理改變?yōu)檐浌峭饣|(zhì)降解和聚蛋白多糖的丟失，聚蛋白多糖酶家族是軟骨基質(zhì)聚蛋白多糖的主要降解酶，與關(guān)節(jié)軟骨退變程度呈正相關(guān)，聚蛋白多糖酶-1和聚蛋白多糖酶-2均屬于凝血酶敏感蛋白基序去整聯(lián)蛋白域和金屬蛋白酶域蛋白(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs, ADAMTs)家族，故又分別命名為ADAMTs-4和ADAMTs-5。目前正清風(fēng)痛寧對(duì)ADAMTs的影響目前尚未見報(bào)道，因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)正清風(fēng)痛寧干預(yù)下實(shí)驗(yàn)動(dòng)物膝關(guān)節(jié)軟骨組織ADAMTs-4、ADAMTs-5的mRNA表達(dá)進(jìn)行分析，旨在進(jìn)一步探討正清風(fēng)痛寧治療骨性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

普通級(jí)4月齡新西蘭兔48只，雌雄各半，體重2.5～2.7 kg，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK (陜) 2017-0014]，西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK (陜) 2017-0102]分籠飼養(yǎng)，保持12 h晝夜節(jié)律，室溫(22±1)℃，自用飲水、攝食。并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷，西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批號(hào)：2017-0016。各組在兔齡、體重、飼養(yǎng)條件等一般資料方面差異均無(wú)顯著性(P> 0.05)，具有可比性。

1.2 主要試劑與儀器

正清風(fēng)痛寧(每片20 mg，湖南正清制藥集團(tuán)股份有限公司)；Trizol(美國(guó)Invitrogen公司)；DHEA(Fluka公司)；RevertAIDTMFirst strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas公司)；聚合酶鏈反應(yīng)試劑(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；GAPDH內(nèi)參和ADAMTs-4、ADAMTs-5引物由大連寶公司合成。石蠟包埋機(jī)(Sakura)；LKB超薄切片機(jī)(Bio-Rad公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組

隨機(jī)取16只兔作為正常對(duì)照組不予處理，建模成功后將建模成功的兔隨機(jī)選取32只分為模型組和觀察組，每組16只，各組在兔齡、性別、體質(zhì)量、飼養(yǎng)條件等一般資料方面差異均無(wú)顯著性(P> 0.05)，具有可比性。

1.3.2 建立骨關(guān)節(jié)炎模型

采用膝關(guān)節(jié)制動(dòng)造模方式[6]制造兔膝骨性關(guān)節(jié)炎模型，造模前實(shí)驗(yàn)動(dòng)物禁食10～16 h，3%戊巴比妥鈉溶液按30 mg/kg劑量耳緣靜脈注射麻醉，左后肢踝關(guān)節(jié)以上剪毛后牽拉膝關(guān)節(jié)處于伸直位，速干型石膏繃帶經(jīng)熱水浸泡軟化后自腹股溝至趾頭固定，以膝關(guān)節(jié)伸直180°、踝關(guān)節(jié)背屈60°，固定后暴露出足趾觀察血液供應(yīng)情況，石膏繃帶外用彈力醫(yī)用繃帶封好，防止實(shí)驗(yàn)動(dòng)物撕咬，制動(dòng)時(shí)間6周，6周后拆除所有繃帶，隨機(jī)抽取一只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死，取關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行病理觀察。造模成功標(biāo)準(zhǔn)[7]：病變關(guān)節(jié)軟骨清表區(qū)粗糙或有炎性腫脹，產(chǎn)生裂隙，深達(dá)輻射區(qū)，深層細(xì)胞數(shù)目異常。

1.3.3 藥物干預(yù)

空白組給予10 mL生理鹽水灌胃。觀察組給予正清風(fēng)痛寧治療，每片含生藥20 mg，成人用藥每日120 mg，根據(jù)Meeh-Rubner公式計(jì)算給藥劑量：成人按60 kg計(jì)算，體表面積=10.6 × (60 0002/3)/10 000=1.625 m2，每日應(yīng)用劑量(g/m2)=120 mg/1.625 m2=73.85 mg/m2，3.0 kg兔體表面積=10.1 × (30002/3)/10 000=0.2101 m2，3.0 kg兔每日劑量(g)=0.2101 m2× 73.85 mg/m2=15.52 mg，每日取15.52 mg正清風(fēng)痛寧溶于10 mL生理鹽水灌胃。模型組每日給予同等劑量生理鹽水灌胃。連續(xù)用藥4周。

1.3.4 大體觀察

藥物干預(yù)4周后，用3%戊巴比妥麻醉實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，分離膝關(guān)節(jié)軟組織，暴露關(guān)節(jié)面，觀察關(guān)節(jié)形態(tài)、關(guān)節(jié)液、關(guān)節(jié)軟骨，關(guān)節(jié)軟骨分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[8]見表1。

1.3.5 光鏡觀察

大體觀察后取脛骨近端部分關(guān)節(jié)軟骨，經(jīng)脫鈣、石蠟包埋、切片、HE染色后制成病理切片，光鏡下觀察，每張圖片取2個(gè)視野，按Mankin’s評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[9]對(duì)軟骨結(jié)構(gòu)(0～3分)、軟骨細(xì)胞數(shù)量(0～3分)、潮線(0～3分)進(jìn)行評(píng)分，得分越高說(shuō)明病變?cè)絿?yán)重。

1.3.6 RT-PCR測(cè)定

取股骨內(nèi)髁軟骨組織約10 mg至1 mL Trizol中勻漿，按說(shuō)明書提取總RNA，PCR擴(kuò)增，95℃預(yù)變性反應(yīng)5 min，每個(gè)循環(huán)變性94℃ 45 s，最佳退火溫度45℃，鏈延伸72℃ 45 s反應(yīng)，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃反應(yīng)10 min，擴(kuò)增產(chǎn)物在2%球脂糖凝膠電源，利用凝膠電源成像系統(tǒng)圖像采集和電源灰度測(cè)定，計(jì)算目的條帶和內(nèi)參照條帶灰度值之比，進(jìn)行半定量分析。GAPDH、ADAMTs-4、ADAMTs-5引物序列和退火溫度見表2。

表1 關(guān)節(jié)軟骨分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Grading standard of articular cartilage

表2 GAPDH、ADAMTs-4、ADAMTs-5引物序列和退火溫度Tab.2 Primer sequences and annealing temperature of the GAPDH, ADAMTs-4 and ADAMTs-5

表3 三組關(guān)節(jié)軟骨分級(jí)比較Tab.3 Comparison of articular cartilage grading of the three groups

注：與空白組相比，aP< 0.05；與模型組相比，bP< 0.05。

Note.Compared with the blank group,aP< 0.05. Compared with the model group,bP< 0.05.

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大體觀察

空白組膝關(guān)節(jié)無(wú)腫大，關(guān)節(jié)表面光滑整齊，無(wú)滑膜增生、骨贅形成，關(guān)節(jié)軟骨透明，關(guān)節(jié)液量少，色淡黃清亮；模型組關(guān)節(jié)軟骨色澤變暗，關(guān)節(jié)軟骨磨損嚴(yán)重，部分骨質(zhì)外露，軟骨邊緣有骨贅形成，關(guān)節(jié)液明顯增多，色澤渾濁；觀察組關(guān)節(jié)軟骨表面粗糙不平，未見明顯骨質(zhì)外露，滑脈有不同程度增生，關(guān)節(jié)液有所增多，色澤渾濁。Radit分析顯示，空白組、模型組和觀察組關(guān)節(jié)軟骨分級(jí)相比較差異有顯著性(P< 0.05)，見表3、圖1。

2.2 光鏡檢查

光鏡檢查結(jié)果和Mankin’s評(píng)分見表4，模型組Mankins’s評(píng)分高于空白組和觀察組，觀察組Mankin’s評(píng)分高于空白組，差異有顯著性(P< 0.05)。見表4、圖2。

2.3 三組ADAMTs-4和ADAMTs-5 mRNA表達(dá)相比較

模型組ADAMTs-4和ADAMTs-5 mRNA表達(dá)顯著高于觀察組和空白組，觀察組ADAMTs-4和ADAMTs-5 mRNA表達(dá)顯著高于空白組，差異有顯著性(P< 0.05)。見表5、圖3。

圖1 三組關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)Fig.1 Articular cartilage morphology in the three groups

表4 三組光鏡檢查結(jié)果和Mankin’s評(píng)分相比較Tab.4 Comparison of light microscopic results and Mankin’s scores of the three groups

注：與空白組相比，aP< 0.05；與模型組相比，bP< 0.05。

Note.Compared with the blank group,aP< 0.05. Compared with the model group,bP< 0.05.

圖2 三組光鏡檢查結(jié)果Fig.2 Microscopic morphology of cartilages in the three groups

表5 三組ADAMTs-4和ADAMTs-5 mRNA表達(dá)相比較Tab.5 Comparison of expressions of ADAMTs-4 and ADAMTs-5 mRNA between the three groups

注：與空白組相比，aP< 0.05；與模型組相比，bP< 0.05。

Note.Compared with the blank group,aP< 0.05. Compared with the model group,bP< 0.05.

圖3 三組ADAMTs-4和ADAMTs-5 mRNA表達(dá)Fig.3 Expression of ADAMTs-4 and ADAMTs-5 mRNA in the three groups

3 討論

聚蛋白多糖擁有巨大分子量，被網(wǎng)在膠原蛋白網(wǎng)架中與散居其中的軟骨細(xì)胞共同構(gòu)成關(guān)節(jié)軟骨，聚蛋白多糖丟失是軟骨破壞主要病理生理表現(xiàn)，引起蛋白聚多糖降解的原因很多，蛋白水解酶活性增高是主要因素[10]。既往研究認(rèn)為基質(zhì)金屬蛋白酶是降解聚蛋白多糖的主要酶類，近年來(lái)的顯示ADAMTs在聚蛋白多糖降解和骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病中發(fā)揮更重要的作用，骨性關(guān)節(jié)炎不同時(shí)期關(guān)節(jié)液中ADAMTs-4和ADAMTs-5作用的降解產(chǎn)物ARGXX均高于基質(zhì)蛋白酶降產(chǎn)物FFPGXX[11 - 12]。體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的研究[13]顯示，抑制ADAMTs-4和ADAMTs-5水平可顯著減少聚蛋白多糖的降解，敲除ADAMs-5基因的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物早期不會(huì)發(fā)生聚蛋白多糖丟失和軟骨破壞[14]。骨關(guān)節(jié)炎模型研究[15]顯示，早期階段僅存在ADAMTs降解產(chǎn)生的NTEGE新抗原表位，不存在基質(zhì)蛋白酶降解產(chǎn)生的VDIPEN抗原，隨著ADAMTs對(duì)聚蛋白多糖的降解進(jìn)展，可檢測(cè)到VDIPEN抗原表位，結(jié)果說(shuō)明ADAMTs對(duì)聚蛋白多糖的降解貫穿于骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病的各個(gè)時(shí)期，基質(zhì)蛋白酶僅在骨關(guān)節(jié)炎的晚期才發(fā)揮作用。因此抑制ADAMTs活性可能是骨關(guān)節(jié)炎干預(yù)的新靶點(diǎn)。

骨關(guān)節(jié)炎屬中醫(yī)“骨痹”范疇，認(rèn)為中年以后，腎氣漸衰精髓內(nèi)虧，骨失所養(yǎng)，加之反復(fù)創(chuàng)傷勞損，風(fēng)寒濕邪內(nèi)侵，閉阻氣血，濕凝成痰，血停為瘀，進(jìn)而深注骨骱，而致關(guān)節(jié)疼痛、強(qiáng)直、畸形，正虛邪實(shí)，相互為用，膠結(jié)難愈，因此風(fēng)寒濕是導(dǎo)致本病的關(guān)鍵因素[16]。正清風(fēng)痛寧為中藥清風(fēng)藤的有效成分青藤堿，《本草綱目》曰：“清風(fēng)藤治風(fēng)濕流注，歷節(jié)鶴膝……”，具有祛風(fēng)通濕、活血通絡(luò)、消腫止痛之功效，是治療風(fēng)濕痹痛的常用中藥[17]。薈萃分析顯示，正清風(fēng)痛寧無(wú)論是聯(lián)合用藥還是單獨(dú)應(yīng)用治療骨性關(guān)節(jié)炎抑制血清IL-1β和TNF-α等炎性因子的效果均優(yōu)于西藥，臨床療效優(yōu)于西藥，但目前對(duì)正清風(fēng)痛寧的研究多限于對(duì)炎性因子的表達(dá)的影響，其更多作用機(jī)制尚未明確，需要進(jìn)一步研究[18]。

骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和研究過(guò)程中，復(fù)制實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型是研究的關(guān)鍵點(diǎn)，鼠類模型關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)與人類不同，且關(guān)節(jié)軟骨不含硫酸角質(zhì)素，兔關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)與人類接近，骨性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型軟骨生化指標(biāo)與人類似，因此本研究試驗(yàn)動(dòng)物選擇兔骨性關(guān)節(jié)炎模型[19]。切斷前交叉韌帶和膝關(guān)節(jié)制動(dòng)是誘導(dǎo)骨性關(guān)節(jié)炎的兩種常用方法，切斷前交叉韌帶可導(dǎo)致關(guān)節(jié)不穩(wěn)，改變力學(xué)環(huán)境，導(dǎo)致關(guān)節(jié)退行性變，誘導(dǎo)骨性關(guān)節(jié)炎，關(guān)節(jié)制動(dòng)在不損傷關(guān)節(jié)穩(wěn)定性的情況下，通過(guò)長(zhǎng)期固定關(guān)節(jié)，限制運(yùn)動(dòng)、肌肉、關(guān)節(jié)囊收縮，誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨的萎縮性變化和骨性關(guān)節(jié)炎[20 - 22]。二者均可成功制作膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎模型，但切斷前交叉韌帶模型造模時(shí)間較長(zhǎng)(需6～8周)，主要首動(dòng)因素為基質(zhì)分解，關(guān)節(jié)制動(dòng)法造模時(shí)間短(需3～6周)，關(guān)節(jié)軟骨損傷和基質(zhì)分解為共同作用機(jī)制[23]。

因此，本研究采用關(guān)節(jié)制動(dòng)法造成關(guān)節(jié)軟骨損傷，結(jié)果顯示，模型組肉眼及顯微鏡下均可關(guān)節(jié)軟骨改變，關(guān)節(jié)軟骨分級(jí)及Mankin’s評(píng)分均顯著高于空白組，ADAMTs-4和ADAMTs-5水平均顯著高于空白組，結(jié)果提示ADAMTs在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病中發(fā)揮重要作用，與有關(guān)研究一致。本研究結(jié)果同時(shí)顯示，觀察組肉眼和光鏡下改變均優(yōu)于模型組，關(guān)節(jié)軟骨分級(jí)及Mankin’s評(píng)分均低于模型組，ADAMTs-4和ADAMTs-5水平低于模型組，結(jié)果提示，正清風(fēng)痛寧可通過(guò)抑制ADAMTs-4和ADAMTs-5抑制聚蛋白多糖降解，促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)，從而達(dá)到治療骨關(guān)節(jié)炎的效果。

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