薛蓉 吳亦潔 李曉晶

摘 要 脫水素是一類植物抗逆相關(guān)蛋白，可幫助植物抵抗干旱、低溫、鹽堿等環(huán)境脅迫。富含賴氨酸的K片段是脫水素中的保守功能片段，在低溫保護(hù)和膜保護(hù)功能中起至關(guān)重要的作用。目前，脫水素及K片段的作用機(jī)理仍不完全清楚。本研究采用圓二色譜（CD）和核磁共振波譜（NMR）方法及分子動力學(xué)模擬計算研究了具有抗菌活性的大米脫水素K片段在模擬膜中的三維結(jié)構(gòu)及其與膜的結(jié)合方式。圓二色譜研究表明，水中呈現(xiàn)無規(guī)卷曲構(gòu)象的K片段在模擬膜中會形成α-螺旋結(jié)構(gòu)。核磁共振結(jié)構(gòu)研究進(jìn)一步證實(shí)了K片段在模擬膜中的空間結(jié)構(gòu)，即中間部分形成了兩親性的α-螺旋結(jié)構(gòu)，其中，疏水殘基位于螺旋結(jié)構(gòu)的一面，親水殘基位于螺旋結(jié)構(gòu)的另一面。擴(kuò)散排序（DOSY）核磁共振實(shí)驗(yàn)表明，K片段與膜在水溶液中形成了穩(wěn)定的結(jié)合體； 順磁性探針檢測表明，整個K片段插入膜中，其中疏水面朝向模擬膜的疏水核，其它部分朝向模擬膜親水表層。本研究得到的K片段在模擬膜中的精細(xì)結(jié)構(gòu)為理解環(huán)境脅迫下K片段及脫水素與膜的作用機(jī)理提供了重要信息。

關(guān)鍵詞 脫水素；核磁共振；三維結(jié)構(gòu)；膜結(jié)合；分子動力學(xué)模擬；K片段

1 引 言

脫水素，又稱二族胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白（LEA蛋白），是一類與植物抗逆反應(yīng)相關(guān)的重要蛋白質(zhì)。這類蛋白質(zhì)在植物胚胎發(fā)育晚期表達(dá)量十分豐富，在環(huán)境脅迫（如干旱、低溫、鹽堿等條件）下也會大量累積[1，2]。因此，脫水素被認(rèn)為是在脅迫過程中對植物起保護(hù)作用的重要物質(zhì)之一，是當(dāng)前抗逆研究方面?zhèn)涫荜P(guān)注的一類蛋白質(zhì)。脫水素的顯著特點(diǎn)是擁有一個或多個富含賴氨酸的保守性K片段。截掉K片段，會使得脫水素ERD10、RcDhn5和TaDHN-5對脫氧脫氫酶（LDH）的低溫保護(hù)活性降低[3，4]。K片段自身也可以對LDH起到低溫保護(hù)作用[5]。 近期研究表明， 脫水素還具有抗菌活性，K片段在其中起關(guān)鍵作用，且K片段自身具有類似全長蛋白的抵抗革蘭氏陽性菌活性[6]。在遭受各種脅迫的情況下，小麥脫水素的K片段通過阻止蛋白聚集對大腸桿菌起到保護(hù)作用，而且K片段也具有抗革蘭氏陰性、陽性菌和真菌的活性[7，8]。河岸葡萄的K片段可以在受到凍融損害時阻止膜融合，并在不改變膜的流動性和表面可及性情況下降低膜轉(zhuǎn)變溫度，對膜起到重要的保護(hù)作用[9]。 上述研究結(jié)果表明， 在脫水素的低溫保護(hù)及抗菌功能中，K片段發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。盡管體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)證明了脫水素及K片段的重要性，但目前對其分子作用機(jī)制仍不完全清楚。功能是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的生化表現(xiàn)特征，結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)行駛功能的基礎(chǔ)。因此，研究脫水素及其重要功能區(qū)域的結(jié)構(gòu)特征是全面認(rèn)識其作用機(jī)制的有效途徑。

脫水素具有高度靈活的結(jié)構(gòu)，它包含大量親水殘基，被認(rèn)為是天然無規(guī)蛋白。然而，當(dāng)環(huán)境發(fā)生改變（如缺水或是與膜表面結(jié)合）時，脫水素可以形成一些有序結(jié)構(gòu)[10]。K片段被預(yù)測可以形成兩親性的螺旋結(jié)構(gòu)，因此推測其與脫水素的結(jié)構(gòu)改變密切相關(guān)[10]。詳細(xì)探究K片段的精細(xì)結(jié)構(gòu)對于揭示K片段，甚至于整個脫水素的作用機(jī)理是非常必要的。核磁共振波譜（NMR）技術(shù)是原位研究溶液中蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的主要分析方法，它不僅可在原子水平上提供蛋白質(zhì)在生理?xiàng)l件下的空間結(jié)構(gòu)[11～13]，還可通過觀察蛋白質(zhì)上個別基團(tuán)的行為特點(diǎn)為分析其分子相互作用等研究提供重要信息。本研究以具有抗菌活性的大米脫水素K片段[6]作為研究對象，利用圓二色譜（CD）、NMR等多種譜學(xué)方法及分子動力學(xué)模擬計算等手段研究了K片段在模擬膜SDS膠束中的三維結(jié)構(gòu)及其與模擬膜的相互作用方式， 為進(jìn)一步了解K片段乃至脫水素抗菌及膜保護(hù)機(jī)理提供了精細(xì)的三維結(jié)構(gòu)及取向信息。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

J-810圓二色譜儀（日本Jasco公司）； AVANCE核磁共振波譜儀（600 MHz，Bruker 公司）。合成肽K片段（KKGFLDKIKEKLPGGHKK，純度>95%，蘇州強(qiáng)耀生物科技有限公司）。重水（D2O， 99.8%）、氘代十二烷基磺酸鈉（SDS-d25， 98%），均購于Cambridge Isotope Laboratories公司。實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 遠(yuǎn)紫外圓二色譜（Far-UV CD） 樣品制備：（1）水溶液中樣品制備：將適量K片段直接溶于水中，肽的濃度為30 μmol/L。（2）SDS中樣品制備：分別將適量K片段和SDS溶于水中，將肽溶液移入SDS溶液，旋轉(zhuǎn)混勻，制得K片段濃度30 μmol/L、SDS濃度10 mmol/L的水溶液樣品。

圓二色譜檢測所用石英比色皿的光程為0.1 cm，波長掃描范圍190～260 nm； 帶寬1.0 nm； 實(shí)驗(yàn)檢測溫度為25℃。每個樣品掃描3次，每張CD譜圖取3次掃描圖的平均值。CD譜圖均已扣除背底，并以平均殘基摩爾橢偏率（θMRE）表示：

θMRE =θobs/10lcn（1）

其中， θobs（mdeg）是實(shí)驗(yàn)所測橢偏率， l（cm）是石英比色皿的路徑長度， c（mol/L）是肽的濃度， n是多肽所含氨基酸個數(shù)。

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)含量通過CDPro軟件分析得到。

2.2.2 核磁共振波譜 樣品制備：稱取1.7 mg K片段溶于220 L水中，稱取31.9 mg SDS-d25溶于275 L水中，將K片段溶液移入SDS-d25溶液，在混合溶液中加入55 L D2O，渦旋混勻，制得550 L的10% D2O-90% H2O的混合溶液，其中，K片段濃度為1.5 mmol/L、SDS-d25濃度為185 mmol/L。

全相關(guān)譜（Total correlation spectroscopy， TOCSY）和核的歐沃豪塞增強(qiáng)譜（Nuclear Overhauser effect spectroscopy， NOESY）檢測均采用壓水峰技術(shù)，混合時間分別為80和150 ms，累積次數(shù)分別為64次和80次。采樣數(shù)據(jù)矩陣2048512，延遲時間2 s，采樣時間0.1548 s，譜寬6613.8 Hz。采用標(biāo)準(zhǔn)Bruker軟件（TOPSPIN 2.1版本）進(jìn)行譜圖處理，處理后的譜圖用SPARKY軟件進(jìn)行分析。選用TSP-d4作為內(nèi)標(biāo)。實(shí)驗(yàn)溫度為298 K。

擴(kuò)散排序（Diffusion-ordered spectroscopy， DOSY）核磁共振實(shí)驗(yàn)溫度為298 K， 采用含有WATERGATE壓水峰技術(shù)的BPPSTE（Bipolar pulse pair stimulated echo）脈沖序列。擴(kuò)散時間為200 ms，梯度脈沖持續(xù)時間為4.5 ms，掃描次數(shù)為8。

2.2.3 結(jié)構(gòu)計算 三維空間結(jié)構(gòu)通過CYANA軟件（1.0.6版本4）計算得到。從200個隨機(jī)的初始結(jié)構(gòu)開始計算，通過幾何空間的模擬退火計算尋找符合構(gòu)象約束的三維結(jié)構(gòu)。得到的結(jié)構(gòu)按目標(biāo)函數(shù)值從小到大進(jìn)行排列，然后利用程序AMBER7對目標(biāo)函數(shù)值排在前20的結(jié)構(gòu)進(jìn)一步進(jìn)行能量優(yōu)化，并用PROCHECK_NMR6程序?qū)Y(jié)構(gòu)進(jìn)行評估。利用MOLMOL7程序進(jìn)行結(jié)構(gòu)可視化分析和繪圖。

3 結(jié)果與討論

3.1 結(jié)構(gòu)分析

許多與抗寒和抗旱相關(guān)的天然無規(guī)蛋白具有一個共同特點(diǎn)，即蛋白序列中都包含能促使蛋白與膜結(jié)合的結(jié)構(gòu)基序。玉米脫水素ZmDHN1的刪除研究表明，K片段可能負(fù)責(zé)將脫水素蛋白結(jié)合到不同膜上[10]，但具體作用殘基及結(jié)合機(jī)理仍不清楚。本研究采用CD譜表征K片段在水溶液中和SDS膠束溶液中的二級結(jié)構(gòu)。如圖1所示，在水溶液中，K片段只在197 nm處有一個負(fù)的最低峰，表現(xiàn)為典型的自由卷曲結(jié)構(gòu)； 在SDS膠束溶液中，K片段在206 和225 nm出現(xiàn)兩個負(fù)的最低峰，在192 nm處出現(xiàn)一個正的最高峰，表明K片段在SDS膠束溶液中主要以α-螺旋結(jié)構(gòu)存在[14]。利用CDPro軟件中CDSSTR程序?qū)﹄牡亩壗Y(jié)構(gòu)含量進(jìn)行計算，得到α-螺旋含量為33.9%， β-折疊含量為21.1%，轉(zhuǎn)角含量為15.8%， 自由卷曲含量為28.8%。上述結(jié)果說明SDS膠束會誘導(dǎo)K片段由無規(guī)結(jié)構(gòu)向α-螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變， 這與一些脅迫蛋白會在膜存在時形成α-螺旋結(jié)構(gòu)[15～17]相類似。

進(jìn)一步利用NMR方法對K片段在SDS膠束溶液中的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。根據(jù)Wüthrich提出的蛋白質(zhì)NMR譜序列識別方法[18]，結(jié)合TOCSY給出的各氨基酸自旋體系的信息以及NOESY給出的歐沃豪斯效應(yīng)關(guān)系對NMR譜圖進(jìn)行歸屬。NOESY譜中大部分相鄰氨基酸殘基間都存在NOE交叉峰，如HNi-HNi+1、Hαi-HNi+1和Hβi-HNi+1，部分不相鄰的氨基酸間也存在NOE交叉峰，如Hαi-HNi+3、 Hαi-Hβi+3和Hαi-HNi+2等（部分NOESY譜圖歸屬見圖2）。其中，連續(xù)的HNi-HNi+1 NOE連接和Hαi-HNi+3、 Hαi-Hβi+3的NOE連接是反映α-螺旋結(jié)構(gòu)的特征連接模式，表明K片段在SDS膠束溶液中主要以α-螺旋結(jié)構(gòu)形式存在。

根據(jù)NOESY譜輸出的NOE連接圖（圖3A）可見，α-螺旋結(jié)構(gòu)的特征連接模式主要存在于G3～L12區(qū)域，表明此區(qū)域形成了α-螺旋結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步通過比較SDS膠束溶液中K片段各個殘基的Hα化學(xué)位移值與它在水溶液中自由卷曲時各殘基的Hα化學(xué)位移值，可獲得化學(xué)位移標(biāo)志（CSI）數(shù)據(jù)。如圖3B所示，F(xiàn)4～E10區(qū)域存在連續(xù)的-1值，表明K片段在此區(qū)域形成了α-螺旋結(jié)構(gòu)。以上核磁共振表征結(jié)果表明，在SDS膠束溶液中K片段的中間部分形成了α-螺旋結(jié)構(gòu)， 與CD結(jié)果一致。

為了進(jìn)一步考察各氨基酸殘基質(zhì)子在空間上的分布情況和相對位置，以NOESY譜圖中給出的化學(xué)位移和NOE強(qiáng)度為NMR約束，利用CYANA程序進(jìn)行了分子動力學(xué)計算。所有NOE中共有177個有意義的上限距離約束，包括84個殘基內(nèi)約束（Intraresidual）、 60個殘基間連接的約束（Sequential）和33個中等范圍的約束（Medium）。根據(jù)NMR約束，利用CYANA軟件，通過模擬退火方式對200個隨機(jī)初始結(jié)構(gòu)在扭轉(zhuǎn)角空間進(jìn)行分子動力學(xué)計算。得到的結(jié)構(gòu)按目標(biāo)函數(shù)值從小到大進(jìn)行排列，然后用程序AMBER7對前20個具有最低目標(biāo)函數(shù)值（平均值為0.0084 nm）的結(jié)構(gòu)（距離約束不超過0.02 nm，角度約束不超過5°）

進(jìn)行能量最小化，求得平均能量為232.17 kcal/mol。圖4A顯示了15個最低能量分子的條帶結(jié)構(gòu)重疊， 從F4至K9定義了一個比較好的α-螺旋結(jié)構(gòu)。對于骨架原子，螺旋區(qū)結(jié)構(gòu)與平均結(jié)構(gòu)的均方根偏差為0.032 nm； 對于所有重原子，均方根偏差為0.13 nm。利用PROCHECK-NMR軟件進(jìn)行Ramachandran分析后發(fā)現(xiàn)，結(jié)構(gòu)收斂較好的殘基中86.7%的骨架二面角落入了最有利區(qū)域（Most favored region），13.3%的骨架二面角落入了額外允許區(qū)域（Additionally allowed region）。MOLMOL計算結(jié)果表明，平均結(jié)構(gòu)（Mean structrue，20個結(jié)構(gòu)的平均）中殘基G3、E10、K11和L12未被包含到α-螺旋結(jié)構(gòu)中，但NOE連接預(yù)測這些殘基是螺旋結(jié)構(gòu)的延伸，CSI數(shù)據(jù)預(yù)測E10為螺旋結(jié)構(gòu)的延伸。從圖4B可見，K片段的螺旋結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出類似兩親性的殘基分布，即疏水殘基F4、L5和I8在一側(cè)，極性殘基D6、K7和E10在另一側(cè)。這種兩親性α-螺旋分布特點(diǎn)將有利于K片段與膜發(fā)生相互作用。

3.2 與模擬膜的結(jié)合

之前的文獻(xiàn)已報道了LEA蛋白與膜之間的相互作用[19，20]。大豆LEA蛋白GmPM28和GmPM1被發(fā)現(xiàn)能夠有效地維持磷脂體系的穩(wěn)定性[19]。豌豆（Pisum sativum）線粒體LEA3蛋白（PsLEAm）能與線粒體膜發(fā)生相互作用，可能是通過形成螺旋構(gòu)象方式保護(hù)脂質(zhì)體[20]。本研究采用核磁的DOSY技術(shù)考察K片段與模擬膜的結(jié)合作用。DOSY技術(shù)可以測定溶液中分子的擴(kuò)散系數(shù)（D），從而間接關(guān)聯(lián)分子的動力學(xué)半徑， 目前已被廣泛用于檢測分子的聚集、配體-受體相互作用等[21，22]。如圖5A所示，位于3.90、1.15和0.73 ppm處的SDS膠束（Mr=18803）譜峰和K片段（Mr=2051.53）譜峰（除SDS膠束和水峰外的所有信號峰）縱坐標(biāo)相同，即擴(kuò)散系數(shù)相同，表明K片段結(jié)合到了模擬膜SDS膠束上，形成穩(wěn)定的結(jié)合體。

進(jìn)一步采用順磁性Mn2+作為探針離子，對K片段各殘基相對SDS膠束的位置進(jìn)行探測，從而確定K片段與模擬膜的作用模式（即K片段在SDS膠束中的取向）。由于弛豫速率增加，靠近Mn2+的原子核的核磁信號強(qiáng)度降低，距離Mn2+越近，核磁信號越弱，甚至消失。因?yàn)镸n2+不能進(jìn)入膠束的疏水核區(qū)域，所以通過比較核磁信號強(qiáng)弱可間接判斷對應(yīng)殘基在溶劑中的暴露程度。本研究考察了K片段在含有0.07 mmol/L MnCl2的SDS膠束溶液的2D1H-1H TOCSY譜交叉峰變化。Mn2+存在下，TOCSY譜中各殘基Hα-HN交叉峰的相對強(qiáng)度如圖5B所示，螺旋區(qū)域（F4～K9）受Mn2+影響相對較小，尤其是殘基F4、L5和D6的信號強(qiáng)度只有小幅減弱，這說明螺旋區(qū)域插入到了SDS膠束當(dāng)中，且以疏水面朝向膠束的疏水內(nèi)核、親水面朝向親水頭基層的方式存在。在C端區(qū)域（E10～K18），Mn2+的加入使得這些殘基的信號強(qiáng)度大幅降低，這表明結(jié)構(gòu)較為無序的C端處于靠近溶劑的SDS膠束表層。N端區(qū)域（K1～G3）在加入Mn2+后，信號降低幅度略小于C端區(qū)域，說明N端區(qū)域插入SDS膠束比C端深。K片段所有區(qū)域中沒有信號完全消失的殘基，說明K片段沒有徹底暴露在水中的殘基。擴(kuò)散及順磁探針實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，K片段具備與膜結(jié)合的能力，支持了它在脫水素保護(hù)作用中負(fù)責(zé)結(jié)合膜的說法。

4 結(jié) 論

盡管脫水素的膜保護(hù)功能及抗菌功能早已為人們所熟知，但對于其作用機(jī)理尚不清楚。本研究采用TOCSY和NOESY等核磁技術(shù)及分子動力學(xué)模擬從原子水平揭示了大米脫水素K片段在模擬膜SDS膠束溶液中的特定三維結(jié)構(gòu)，并通過擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)、順磁探針實(shí)驗(yàn)考察了K片段在SDS膠束中的取向。本研究結(jié)果表明，K片段可能通過形成兩親性α-螺旋結(jié)構(gòu)起到與細(xì)胞膜結(jié)合并進(jìn)入細(xì)胞膜的作用。其中，疏水殘基F4、L5和I8形成螺旋結(jié)構(gòu)的疏水面，便于K片段穩(wěn)定存在于模擬膜中，這與近期研究發(fā)現(xiàn)疏水殘基對脫水素功能至關(guān)重要[23]相一致。以上結(jié)果為K片段與膜的生物作用機(jī)制研究提供了重要的結(jié)構(gòu)信息，也將為研究脫水素的膜保護(hù)功能及抗菌功能提供新的參考。

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